გმადლობთ Nature.com-ის მონახულებისთვის.ბრაუზერის ვერსიას, რომელსაც იყენებთ, აქვს შეზღუდული CSS მხარდაჭერა.საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში).იმავდროულად, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ გამოვიყვანთ საიტს სტილის და JavaScript-ის გარეშე.
Toxoplasma gondii არის უჯრედშიდა პროტოზოული პარაზიტი, რომელიც ახდენს ინფიცირებული მასპინძლის მიკროგარემოს მოდულირებას და ცნობილია, რომ დაკავშირებულია ტვინის სიმსივნის ზრდის სიხშირესთან.ამ კვლევაში ჩვენ ვარაუდობთ, რომ ეგზოსომური miRNA-21 ტოქსოპლაზმის ინფექციისგან ხელს უწყობს ტვინის სიმსივნის ზრდას.ტოქსოპლაზმით ინფიცირებული BV2 მიკროგლიიდან ეგზოსომები დახასიათდა და დადასტურდა U87 გლიომის უჯრედების ინტერნალიზება.ეგზოსომური მიკრორნმ-ის ექსპრესიის პროფილები გაანალიზებული იყო მიკრორნმ-ის და მიკრორნმ-21A-5p მასივების გამოყენებით, რომლებიც დაკავშირებულია Toxoplasma gondii-სთან და სიმსივნის დახარისხებასთან.ჩვენ ასევე გამოვიკვლიეთ სიმსივნური ასოცირებული გენების mRNA დონეები U87 გლიომის უჯრედებში miR-21 დონის შეცვლით ეგზოსომებში და ეგზოსომების ეფექტი ადამიანის U87 გლიომის უჯრედების პროლიფერაციაზე.Toxoplasma gondii-ით ინფიცირებულ U87 გლიომის უჯრედების ეგზოსომებში, მიკრორნმ-21-ის ექსპრესია გაიზარდა და ანტისიმსივნური გენების (FoxO1, PTEN და PDCD4) აქტივობა მცირდება.ტოქსოპლაზმით ინფიცირებული BV2-დან მიღებული ეგზოსომები იწვევენ U87 გლიომის უჯრედების პროლიფერაციას.ეგზოსომები იწვევენ U87 უჯრედების ზრდას თაგვის სიმსივნის მოდელში.ჩვენ ვარაუდობთ, რომ გაზრდილი ეგზოსომური miR-21 ტოქსოპლაზმით ინფიცირებულ BV2 მიკროგლიაში შეიძლება ითამაშოს მნიშვნელოვანი როლი, როგორც უჯრედის ზრდის პრომოუტერი U87 გლიომის უჯრედებში, სიმსივნის საწინააღმდეგო გენების დაქვეითებით.
შეფასებულია, რომ 2018 წელს მსოფლიოში დაფიქსირდა 18.1 მილიონზე მეტი მოწინავე კიბოს დიაგნოზი, ყოველწლიურად დიაგნოზირებულია ცენტრალური ნერვული სისტემის დაახლოებით 297,000 სიმსივნე (ყველა სიმსივნეების 1.6%)1.წინა კვლევებმა აჩვენა, რომ ადამიანის ტვინის სიმსივნის განვითარების რისკ-ფაქტორები მოიცავს სხვადასხვა ქიმიურ პროდუქტს, ოჯახის ისტორიას და მაიონებელ გამოსხივებას თავის თერაპიული და დიაგნოსტიკური აღჭურვილობისგან.თუმცა, ამ ავთვისებიანი სიმსივნეების ზუსტი მიზეზი უცნობია.მსოფლიოში ყველა კიბოს დაახლოებით 20% გამოწვეულია ინფექციური აგენტებით, მათ შორის ვირუსებით, ბაქტერიებითა და პარაზიტებით3,4.ინფექციური პათოგენები არღვევენ მასპინძელი უჯრედის გენეტიკურ მექანიზმებს, როგორიცაა დნმ-ის შეკეთება და უჯრედის ციკლი, და შეიძლება გამოიწვიოს ქრონიკული ანთება და იმუნური სისტემის დაზიანება5.
ადამიანის კიბოსთან დაკავშირებული ინფექციური აგენტები ყველაზე გავრცელებული ვირუსული პათოგენებია, მათ შორის ადამიანის პაპილომავირუსები და B და C ჰეპატიტის ვირუსები.პარაზიტებს ასევე შეუძლიათ პოტენციური როლი შეასრულონ ადამიანის კიბოს განვითარებაში.პარაზიტების რამდენიმე სახეობა, კერძოდ, Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis და Hymenolepis nana, ჩართული იყო ადამიანის კიბოს სხვადასხვა ტიპებში 6,7,8.
Toxoplasma gondii არის უჯრედშიდა პროტოზოული, რომელიც არეგულირებს ინფიცირებული მასპინძელი უჯრედების მიკროგარემოს.ეს პარაზიტი, სავარაუდოდ, აინფიცირებს მსოფლიოს მოსახლეობის დაახლოებით 30%-ს, რაც საფრთხეს უქმნის მთელ მოსახლეობას9,10.Toxoplasma gondii-მ შეიძლება დააინფიციროს სასიცოცხლო ორგანოები, მათ შორის ცენტრალური ნერვული სისტემა (ცნს) და გამოიწვიოს ისეთი სერიოზული დაავადებები, როგორიცაა ფატალური მენინგიტი და ენცეფალიტი, განსაკუთრებით იმუნოდეფიციტის მქონე პაციენტებში9.თუმცა, Toxoplasma gondii-ს შეუძლია ასევე შეცვალოს ინფიცირებული მასპინძლის გარემო უჯრედების ზრდისა და იმუნური პასუხების მოდულირებით იმუნოკომპეტენტურ ინდივიდებში, რაც იწვევს უსიმპტომო ქრონიკული ინფექციის შენარჩუნებას9,11.საინტერესოა, რომ კორელაციის გათვალისწინებით T. gondii გავრცელებასა და ტვინის სიმსივნის სიხშირეს შორის, ზოგიერთი მოხსენება ვარაუდობს, რომ in vivo მასპინძელი გარემო ცვლილებებს ქრონიკული T. gondii ინფექციის გამო ემსგავსება სიმსივნის მიკროგარემოს.
ეგზოსომები ცნობილია, როგორც უჯრედშორისი კომუნიკატორები, რომლებიც აწვდიან ბიოლოგიურ შინაარსს, ცილების და ნუკლეინის მჟავების ჩათვლით, მეზობელი უჯრედებიდან16,17.ეგზოსომებს შეუძლიათ გავლენა მოახდინონ სიმსივნესთან დაკავშირებულ ბიოლოგიურ პროცესებზე, როგორიცაა ანტიაპოპტოზი, ანგიოგენეზი და მეტასტაზები სიმსივნის მიკროგარემოში.კერძოდ, miRNAs (miRNAs), მცირე არაკოდირების რნმ-ები, დაახლოებით 22 ნუკლეოტიდის სიგრძით, მნიშვნელოვანი პოსტტრანსკრიპციული გენის რეგულატორებია, რომლებიც აკონტროლებენ ადამიანის mRNA-ს 30%-ზე მეტს miRNA-ით გამოწვეული დუმილის კომპლექსის (miRISC) მეშვეობით.Toxoplasma gondii-ს შეუძლია დაარღვიოს ბიოლოგიური პროცესები ინფიცირებულ მასპინძლებში miRNA ექსპრესიის კონტროლით.მასპინძელი miRNAs შეიცავს მნიშვნელოვან სიგნალებს მასპინძლის ბიოლოგიური პროცესების რეგულირებისთვის პარაზიტის გადარჩენის სტრატეგიის მისაღწევად.ამრიგად, მასპინძლის miRNA პროფილის ცვლილებების შესწავლა T. gondii-ით ინფექციით, დაგვეხმარება უფრო ნათლად გავიგოთ მასპინძელსა და T. gondii-ს შორის ურთიერთქმედება.მართლაც, Thirugnanam et al.15 ვარაუდობს, რომ T. gondii ხელს უწყობს ტვინის კარცინოგენეზს მისი ექსპრესიის შეცვლით სპეციფიკურ მასპინძელ miRNA-ებზე, რომლებიც დაკავშირებულია სიმსივნის ზრდასთან და დაადგინა, რომ T. gondii შეიძლება გამოიწვიოს გლიომები ექსპერიმენტულ ცხოველებში.
ეს კვლევა ფოკუსირებულია ეგზოსომური miR-21-ის ცვლილებაზე Toxoplasma BV2-ით ინფიცირებულ მასპინძელ მიკროგლიაში.ჩვენ დავაკვირდით შეცვლილი ეგზოსომური miR-21-ის შესაძლო როლს U87 გლიომის უჯრედების ზრდაში FoxO1/p27-ის ბირთვში შეკავების გამო, რომელიც არის გადაჭარბებული miR-21-ის სამიზნე.
BV2-დან მიღებული ეგზოსომები მიღებულ იქნა დიფერენციალური ცენტრიფუგაციის გამოყენებით და დადასტურდა სხვადასხვა მეთოდით, რათა თავიდან იქნას აცილებული უჯრედული კომპონენტებით ან სხვა ვეზიკულებით დაბინძურება.SDS-პოლიაკრილამიდის გელის ელექტროფორეზი (SDS-PAGE) აჩვენა მკაფიო ნიმუშები BV2 უჯრედებიდან ამოღებულ პროტეინებსა და ეგზოსომებს შორის (სურათი 1A) და ნიმუშები შეფასებული იყო ალიქსის არსებობაზე, რომელიც გაანალიზებული იყო ეგზოსომური ცილის მარკერების Western blotting-ით.ალიქსის მარკირება ნაპოვნი იქნა ეგზოსომების პროტეინებში, მაგრამ არა BV2 უჯრედის ლიზატის პროტეინებში (ნახ. 1B).გარდა ამისა, BV2-დან მიღებული ეგზოსომების გასუფთავებული რნმ გაანალიზდა ბიოანალიზატორის გამოყენებით.18S და 28S რიბოსომური ქვედანაყოფები იშვიათად შეინიშნებოდა ეგზოსომური რნმ-ის მიგრაციის ნიმუშში, რაც მიუთითებს საიმედო სიწმინდეს (სურათი 1C).საბოლოოდ, გადამცემმა ელექტრონულმა მიკროსკოპამ აჩვენა, რომ დაკვირვებული ეგზოსომები იყო დაახლოებით 60-150 ნმ ზომის და ჰქონდათ ჭიქის მსგავსი სტრუქტურა ეგზოსომების მორფოლოგიისთვის დამახასიათებელი (ნახ. 1D).
BV2 უჯრედებიდან მიღებული ეგზოსომების დახასიათება.(A) უსაფრთხოების მონაცემების გვერდი.ცილები იზოლირებული იყო BV2 უჯრედებიდან ან BV2-დან მიღებული ეგზოსომებიდან.ცილის შაბლონები განსხვავდება უჯრედებსა და ეგზოზომებს შორის.(B) ეგზოსომური მარკერის Western blot ანალიზი (ალიქსი).(C) გასუფთავებული რნმ-ის შეფასება BV2 უჯრედებიდან და BV2 მიღებული ეგზოსომებიდან ბიოანალიზატორის გამოყენებით.ამრიგად, 18S და 28S რიბოსომური ქვედანაყოფები BV2 უჯრედებში იშვიათად გვხვდება ეგზოსომურ რნმ-ში.(D) გადაცემის ელექტრონულმა მიკროსკოპამ აჩვენა, რომ BV2 უჯრედებიდან იზოლირებული ეგზოსომები უარყოფითად იყო შეღებილი 2% ურანილის აცეტატით.ეგზოსომები დაახლოებით 60-150 ნმ ზომის და თასის ფორმისაა (სონგი და იუნგი, გამოუქვეყნებელი მონაცემები).
BV2-დან მიღებული ეგზოსომების უჯრედული ინტერნალიზაცია U87 ადამიანის გლიომის უჯრედებში დაფიქსირდა კონფოკალური მიკროსკოპის გამოყენებით.PKH26 მარკირებული ეგზოსომები ლოკალიზებულია U87 უჯრედების ციტოპლაზმაში.ბირთვები შეღებილი იყო DAPI-ით (ნახ. 2A), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ BV2-დან მიღებული ეგზოსომები შეიძლება იყოს ინტერნალიზებული მასპინძელი უჯრედების მიერ და გავლენა მოახდინოს მიმღები უჯრედების გარემოზე.
BV2-დან მიღებული ეგზოსომების ინტერნალიზება U87 გლიომის უჯრედებში და BV2-გან მიღებული ეგზოსომები, რომლებიც ინფიცირებულია Toxoplasma RH-ით, გამოიწვია U87 გლიომის უჯრედების პროლიფერაცია.(A) U87 უჯრედების მიერ გაჟღენთილი ეგზოსომები, რომლებიც იზომება კონფოკალური მიკროსკოპით.U87 გლიომის უჯრედები ინკუბირებული იყო ეგზოსომებით ეტიკეტირებული PKH26-ით (წითელი) ან კონტროლის გარეშე 24 საათის განმავლობაში.ბირთვები შეიღება DAPI-ით (ლურჯი) და შემდეგ დაკვირვება კონფოკალური მიკროსკოპით (მასშტაბის ზოლი: 10 μm, x 3000).(B) U87 გლიომის უჯრედების პროლიფერაცია განისაზღვრა უჯრედის პროლიფერაციის ანალიზით.U87 გლიომის უჯრედები დამუშავდა ეგზოზომებით მითითებული დროის განმავლობაში. *P <0.05 მიღებული იქნა Student's t ტესტით. *P <0.05 მიღებული იქნა Student's t ტესტით. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P <0.05 სტუდენტის t-ტესტით. *P <0.05 通过学生t 检验获得. *P <0.05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 მიღებული Student's t-ტესტით.
BV2-დან მიღებული ეგზოსომების U87 გლიომის უჯრედებში ინტერნალიზაციის დადასტურების შემდეგ, ჩვენ ჩავატარეთ უჯრედების პროლიფერაციის ანალიზები, რათა გამოგვეკვლია BV2-დან მიღებული ტოქსოპლაზმიდან მიღებული ეგზოსომების როლი ადამიანის გლიომის უჯრედების განვითარებაში.U87 უჯრედების დამუშავებამ ეგზოსომებით T. gondii-ით ინფიცირებული BV2 უჯრედებიდან აჩვენა, რომ T. gondii-ით ინფიცირებული BV2-დან მიღებული ეგზოსომები იწვევდნენ U87 უჯრედების მნიშვნელოვნად უფრო მაღალ პროლიფერაციას კონტროლთან შედარებით (ნახ. 2B).
გარდა ამისა, U118 უჯრედების ზრდას ჰქონდა იგივე შედეგები, რაც U87-ს, რადგან ტოქსოპლაზმით სტიმულირებული ეგზოსომები იწვევდნენ პროლიფერაციის ყველაზე მაღალ დონეს (მონაცემები არ არის ნაჩვენები).ამ მონაცემებზე დაყრდნობით შეგვიძლია მივუთითოთ, რომ BV2-ით მიღებული ტოქსოპლაზმით ინფიცირებული ეგზოსომები მნიშვნელოვან როლს თამაშობენ გლიომის უჯრედების პროლიფერაციაში.
ტოქსოპლაზმით ინფიცირებული BV2-დან მიღებული ეგზოსომების ზემოქმედების გამოსაკვლევად სიმსივნის განვითარებაზე, ჩვენ ჩავუშვით U87 გლიომის უჯრედები შიშველ თაგვებში ქსენოტრანსპლანტაციის მოდელისთვის და ჩავუშვით BV2-დან მიღებული ეგზოსომები ან RH-ინფიცირებული BV2-გან მიღებული ეგზოსომები.მას შემდეგ, რაც სიმსივნე გამოვლინდა 1 კვირის შემდეგ, 5 თაგვისგან შემდგარი თითოეული ექსპერიმენტული ჯგუფი გაიყო სიმსივნის ზომის მიხედვით, რათა დადგინდეს იგივე საწყისი წერტილი და სიმსივნის ზომა გაზომეს 22 დღის განმავლობაში.
თაგვებში U87 ქსენოგრაფტის მოდელით, სიმსივნის მნიშვნელოვნად დიდი ზომა და წონა დაფიქსირდა BV2-დან მიღებული RH-ით ინფიცირებული ეგზოსომების ჯგუფში 22 დღეს (ნახ. 3A,B).მეორეს მხრივ, არ იყო მნიშვნელოვანი განსხვავება სიმსივნის ზომაში BV2-ით მიღებულ ეგზოზომის ჯგუფსა და საკონტროლო ჯგუფს შორის ეგზოსომური მკურნალობის შემდეგ.გარდა ამისა, თაგვებმა, რომლებსაც გაუკეთეს გლიომის უჯრედები და ეგზოსომები, ვიზუალურად აჩვენებდნენ სიმსივნის ყველაზე დიდ მოცულობას RH-ით ინფიცირებული BV2-დან მიღებული ეგზოსომების ჯგუფში (ნახ. 3C).ეს შედეგები აჩვენებს, რომ BV2-დან მიღებული ტოქსოპლაზმით ინფიცირებული ეგზოსომები იწვევენ გლიომის ზრდას თაგვის სიმსივნის მოდელში.
BV2-დან მიღებული ეგზოსომების ონკოგენეზი (AC) U87 ქსენოტრანსპლანტატი თაგვის მოდელში.სიმსივნის ზომა (A) და წონა (B) მნიშვნელოვნად გაიზარდა BALB/c შიშველ თაგვებში, რომლებსაც მკურნალობდნენ BV2-დან მიღებული RH ინფიცირებული ეგზოზომებით.BALB/c შიშველ თაგვებს (C) კანქვეშ გაუკეთეს 1 x 107 U87 უჯრედი შეჩერებული მატრიგელის ნარევში.ინექციიდან ექვსი დღის შემდეგ, თაგვებში მკურნალობდნენ 100 მკგ BV2-დან მიღებული ეგზოზომები.სიმსივნის ზომა და წონა გაზომილი იყო მითითებულ დღეებში და მსხვერპლშეწირვის შემდეგ, შესაბამისად. *P <0.05. *P <0.05. *Р < 0,05. *P <0.05. *P <0.05. *P <0.05. *Р < 0,05. *P <0.05.
მონაცემებმა აჩვენა, რომ 37 miRNA (16 ზედმეტად გამოხატული და 21 დაქვეითებული), დაკავშირებული იმუნიტეტთან ან სიმსივნის განვითარებასთან, მნიშვნელოვნად შეიცვალა მიკროგლიაში ტოქსოპლაზმის RH შტამით ინფექციის შემდეგ (ნახ. 4A).miR-21-ის შედარებითი გამოხატვის დონეები შეცვლილ miRNA-ებს შორის დადასტურდა რეალურ დროში RT-PCR-ით BV2-დან წარმოებულ ეგზოსომებში, BV2 და U87 უჯრედებით დამუშავებულ ეგზოზომებში.miR-21-ის ექსპრესიამ აჩვენა ეგზოზომების მნიშვნელოვანი ზრდა BV2 უჯრედებიდან ინფიცირებული Toxoplasma gondii (RH შტამი) (ნახ. 4B).miR-21-ის ფარდობითი გამოხატვის დონე BV2 და U87 უჯრედებში გაიზარდა შეცვლილი ეგზოსომების მიღების შემდეგ (ნახ. 4B).miR-21 გამოხატვის ფარდობითი დონეები სიმსივნური პაციენტებისა და Toxoplasma gondii-ით (ME49 შტამი) ინფიცირებული თაგვების ტვინის ქსოვილებში უფრო მაღალი იყო, ვიდრე კონტროლში, შესაბამისად (ნახ. 4C).ეს შედეგები დაკავშირებულია განსხვავებებს შორის პროგნოზირებული და დადასტურებული მიკრორნმ-ების ექსპრესიის დონეებს in vitro და in vivo.
ცვლილებები ეგზოსომური miP-21a-5p-ის ექსპრესიაში Toxoplasma gondii-ით (RH) ინფიცირებულ მიკროგლიებში.(A) აჩვენებს მნიშვნელოვან ცვლილებებს siRNA-ში, რომელიც დაკავშირებულია იმუნიტეტთან ან სიმსივნის განვითარებასთან T. gondii RH ინფექციის შემდეგ.(B) miR-21 გამოხატვის ფარდობითი დონეები გამოვლინდა რეალურ დროში RT-PCR-ით BV2-დან მიღებულ ეგზოსომებში, BV2-ით დამუშავებულ ეგზოსომებში და U87 უჯრედებში.(C) miR-21 გამოხატვის შედარებითი დონე აღმოაჩინეს სიმსივნური პაციენტების ტვინის ქსოვილებში (N=3) და თაგვებში ინფიცირებული Toxoplasma gondii (ME49 შტამი) (N=3). *P <0.05 მიღებული იქნა Student's t ტესტით. *P <0.05 მიღებული იქნა Student's t ტესტით. *P < 0,05 было получено со помощью t-критерия Стьюдента. *P <0.05 მიღებული იქნა Student-ის t-ტესტის გამოყენებით. *P <0.05 通过学生t 检验获得. *P <0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 მიღებული Student's t-ტესტით.
RH-ით ინფიცირებული BV2 უჯრედების ეგზოზომებმა გამოიწვია გლიომების ზრდა in vivo და in vitro (ნახ. 2, 3).შესაბამისი mRNA-ების გამოსავლენად, ჩვენ გამოვიკვლიეთ ანტისიმსივნური სამიზნე გენების mRNA დონეები, ჩანგლის ყუთი O1 (FoxO1), PTEN და დაპროგრამებული უჯრედის სიკვდილი 4 (PDCD4) U87 უჯრედებში, რომლებიც ინფიცირებულია BV2 ან RH BV2-დან მიღებული ეგზოსომებით.ბიოინფორმატიკის ანალიზმა აჩვენა, რომ სიმსივნესთან ასოცირებულ რამდენიმე გენს, მათ შორის FoxO1, PTEN და PDCD4 გენებს, აქვთ miR-2121,22 დამაკავშირებელი ადგილები.ანტისიმსივნური სამიზნე გენების mRNA დონეები შემცირდა RH-ით ინფიცირებულ BV2-დან გამოყვანილ ეგზოსომებში BV2-გან მიღებული ეგზოსომებთან შედარებით (ნახ. 5A).FoxO1-მა აჩვენა შემცირებული ცილის დონეები RH-ით ინფიცირებულ BV2-გან წარმოქმნილ ეგზოსომებში BV2-გან მიღებული ეგზოსომებთან შედარებით (სურათი 5B).ამ შედეგების საფუძველზე, ჩვენ შეგვიძლია დავადასტუროთ, რომ RH-ით ინფიცირებული BV2-დან მიღებული ეგზოსომები ამცირებენ ანტიონკოგენურ გენებს, ინარჩუნებენ მათ როლს სიმსივნის ზრდაში.
ტოქსოპლაზმით RH ინფიცირებული BV2-დან მიღებული ეგზოსომები იწვევენ ანტისიმსივნური გენების დათრგუნვას U87 გლიომის უჯრედებში Toxoplasma RH-ით ინფიცირებული BV2-დან მიღებული ეგზოსომებით.(A) FoxO1, PTEN და PDCD4 ექსპრესიის რეალურ დროში PCR T. gondii RH ინფიცირებული BV2-დან მიღებული ეგზოსომებში PBS ეგზოსომებთან შედარებით.β-აქტინის mRNA იყო გამოყენებული, როგორც კონტროლი.(B) FoxO1 გამოხატულება განისაზღვრა Western blotting-ით და დენსიტომეტრიის მონაცემები სტატისტიკურად შეფასდა ImageJ პროგრამის გამოყენებით. *P <0.05 მიღებული იქნა Student's t ტესტით. *P <0.05 მიღებული იქნა Student's t ტესტით. *P < 0,05 было получено со помощью t-критерия Стьюдента. *P <0.05 მიღებული იქნა Student-ის t-ტესტის გამოყენებით. *P <0.05 通过学生t 检验获得. *P <0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 მიღებული Student's t-ტესტით.
ეგზოსომებში miP-21-ის ეფექტის გასაგებად სიმსივნესთან ასოცირებულ გენის რეგულაციაზე, U87 უჯრედები გადაკეთდა miP-21 ინჰიბიტორით Lipofectamine 2000-ის გამოყენებით და უჯრედები აღებული იქნა ტრანსფექციის შემდეგ 24 საათის შემდეგ.FoxO1 და p27 გამოხატვის დონეები უჯრედებში, რომლებიც ტრანსფექციულ იქნა miR-21 ინჰიბიტორებით, შეადარეს უჯრედებს, რომლებიც დამუშავებულნი იყვნენ BV2-დან მიღებული ეგზოსომებით qRT-PCR-ის გამოყენებით (ნახ. 6A,B).miR-21 ინჰიბიტორის U87 უჯრედებში ტრანსფექციამ მნიშვნელოვნად შეამცირა FoxO1 და p27 ექსპრესია (სურათი 6).
RH-ით ინფიცირებული ეგზოსომური BV2-დან მიღებული miP-21-მა შეცვალა FoxO1/p27 ექსპრესია U87 გლიომის უჯრედებში.U87 უჯრედები გადაკეთდა miP-21 ინჰიბიტორით Lipofectamine 2000-ის გამოყენებით და უჯრედები აღებული იქნა ტრანსფექციის შემდეგ 24 საათის შემდეგ.FoxO1 და p27 ექსპრესიის დონეები უჯრედებში, რომლებიც ტრანსფექციულ იქნა miR-21 ინჰიბიტორებით, შედარებული იყო დონეებთან უჯრედებში, რომლებიც მკურნალობდნენ BV2-დან მიღებული ეგზოზომებით qRT-PCR (A, B) გამოყენებით.
მასპინძლის იმუნური პასუხისგან თავის დასაღწევად, ტოქსოპლაზმის პარაზიტი ქსოვილის კისტად გარდაიქმნება.ისინი პარაზიტირებენ სხვადასხვა ქსოვილებს, მათ შორის თავის ტვინს, გულს და ჩონჩხის კუნთს, მასპინძლის მთელი სიცოცხლის განმავლობაში და არეგულირებენ მასპინძლის იმუნურ პასუხს.გარდა ამისა, მათ შეუძლიათ მასპინძელი უჯრედების უჯრედული ციკლის და აპოპტოზის რეგულირება, რაც ხელს უწყობს მათ გამრავლებას14,24.Toxoplasma gondii უპირატესად აინფიცირებს მასპინძელ დენდრიტულ უჯრედებს, ნეიტროფილებს და მონოციტების/მაკროფაგების შტოს, ტვინის მიკროგლიის ჩათვლით.Toxoplasma gondii იწვევს M2 ფენოტიპის მაკროფაგების დიფერენციაციას, გავლენას ახდენს ჭრილობის შეხორცებაზე პათოგენური ინფექციის შემდეგ და ასევე ასოცირდება ჰიპერვასკულარიზაციასთან და გრანულომატოზურ ფიბროზთან.ტოქსოპლაზმის ინფექციის ეს ქცევითი პათოგენეზი შეიძლება დაკავშირებული იყოს სიმსივნის განვითარებასთან დაკავშირებულ მარკერებთან.ტოქსოპლაზმის მიერ რეგულირებული მტრული გარემო შეიძლება დაემსგავსოს შესაბამის კიბოსწინარეს.აქედან გამომდინარე, შეიძლება ვივარაუდოთ, რომ ტოქსოპლაზმის ინფექციამ ხელი უნდა შეუწყოს ტვინის სიმსივნეების განვითარებას.ფაქტობრივად, ტოქსოპლაზმით ინფექციის მაღალი მაჩვენებელი დაფიქსირდა ტვინის სხვადასხვა სიმსივნის მქონე პაციენტების შრატში.გარდა ამისა, Toxoplasma gondii შეიძლება იყოს კიდევ ერთი კანცეროგენული ეფექტორი და იმოქმედოს სინერგიულად, რათა დაეხმაროს სხვა ინფექციურ კანცეროგენებს ტვინის სიმსივნეების განვითარებაში.ამასთან დაკავშირებით, აღსანიშნავია, რომ P. falciparum და ეპშტეინ-ბარის ვირუსი სინერგიულად უწყობს ხელს ბურკიტის ლიმფომის წარმოქმნას.
ექსოსომების, როგორც რეგულატორების როლი კიბოს კვლევის სფეროში ფართოდ იქნა გამოკვლეული.თუმცა, ეგზოსომების როლი პარაზიტებსა და ინფიცირებულ მასპინძლებს შორის ჯერ კიდევ ცუდად არის გასაგები.ჯერჯერობით, სხვადასხვა რეგულატორები, მათ შორის გამოყოფილი ცილები, ხსნიან ბიოლოგიურ პროცესებს, რომლითაც პროტოზოული პარაზიტები წინააღმდეგობას უწევენ მასპინძლის შეტევას და აგრძელებენ ინფექციას.ბოლო დროს გაჩნდა მზარდი კონცეფცია, რომ პროტოზოებთან ასოცირებული მიკროვეზიკულები და მათი მიკრორნმ ურთიერთქმედებენ მასპინძელ უჯრედებთან, რათა შექმნან ხელსაყრელი გარემო მათი გადარჩენისთვის.აქედან გამომდინარე, საჭიროა შემდგომი კვლევები, რათა აღმოაჩინონ კავშირი შეცვლილ ეგზოსომურ miRNA-სა და გლიომის უჯრედების პროლიფერაციას შორის.მიკრორნმ-ის ცვლილება (კლასტერული გენები miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 და miR-17-92) უკავშირდება STAT3 პრომოტორს ტოქსოპლაზმით ინფიცირებულ ადამიანის მაკროფაგებში, რეგულირდება და იწვევს ანტი -აპოპტოზი Toxoplasma gondii ინფექციის საპასუხოდ 29 .ტოქსოპლაზმური ინფექცია ზრდის miR-17-5p და miR-106b-5p გამოხატულებას, რომლებიც დაკავშირებულია რამდენიმე ჰიპერპროლიფერაციულ დაავადებასთან 30 .ეს მონაცემები ვარაუდობს, რომ მასპინძელი miRNA-ები, რომლებიც რეგულირდება ტოქსოპლაზმის ინფექციით, მნიშვნელოვანი მოლეკულებია პარაზიტების გადარჩენისა და პათოგენეზისთვის მასპინძლის ბიოლოგიურ ქცევაში.
შეცვლილ miRNA-ებს შეუძლიათ გავლენა მოახდინონ სხვადასხვა სახის ქცევაზე ავთვისებიანი უჯრედების დაწყებისა და პროგრესირების დროს, მათ შორის გლიომებს: ზრდის სიგნალების თვითკმარობა, ზრდის ინჰიბირებელი სიგნალებისადმი მგრძნობელობა, აპოპტოზის აცილება, შეუზღუდავი რეპლიკაციური პოტენციალი, ანგიოგენეზი, ინვაზია და მეტასტაზები და ანთება.გლიომაში, შეცვლილი miRNAs გამოვლენილია რამდენიმე ექსპრესიის პროფილირების კვლევაში.
წინამდებარე კვლევაში ჩვენ დავადასტურეთ miRNA-21 ექსპრესიის მაღალი დონე ტოქსოპლაზმით ინფიცირებულ მასპინძელ უჯრედებში.miR-21 იდენტიფიცირებულია, როგორც ერთ-ერთი ყველაზე ხშირად ზედმეტად გამოხატული მიკრორნმ მყარ სიმსივნეებში, მათ შორის გლიომებში, 33 და მისი გამოხატულება დაკავშირებულია გლიომის ხარისხთან.დაგროვილი მტკიცებულება ვარაუდობს, რომ miR-21 არის ახალი ონკოგენი, რომელიც მოქმედებს როგორც ანტი-აპოპტოზური ფაქტორი გლიომის ზრდაში და ძალიან ჭარბად არის გამოხატული ადამიანის ტვინის ავთვისებიანი სიმსივნეების ქსოვილებსა და პლაზმაში.საინტერესოა, რომ miR-21 ინაქტივაცია გლიომის უჯრედებსა და ქსოვილებში იწვევს უჯრედების პროლიფერაციის ინჰიბირებას კასპაზაზე დამოკიდებული აპოპტოზის გამო.miR-21 პროგნოზირებული სამიზნეების ბიოინფორმატიულმა ანალიზმა გამოავლინა მრავალი სიმსივნის სუპრესორული გენი, რომლებიც დაკავშირებულია აპოპტოზის ბილიკებთან, მათ შორის დაპროგრამებული უჯრედის სიკვდილი 4 (PDCD4), ტროპომიოზინი (TPM1), PTEN და ჩანგლის ყუთი O1 (FoxO1), miR-2121 შეკავშირების ადგილით..22.38.
FoxO1, როგორც ტრანსკრიფციის ერთ-ერთი ფაქტორი (FoxO), მონაწილეობს ადამიანის სხვადასხვა ტიპის კიბოს განვითარებაში და შეუძლია დაარეგულიროს სიმსივნის სუპრესორული გენების ექსპრესია, როგორიცაა p21, p27, Bim და FasL40.FoxO1-ს შეუძლია დააკავშიროს და გაააქტიუროს უჯრედული ციკლის ინჰიბიტორები, როგორიცაა p27, რათა დათრგუნოს უჯრედების ზრდა.გარდა ამისა, FoxO1 არის PI3K/Akt სიგნალიზაციის მთავარი ეფექტორი და არეგულირებს ბევრ ბიოლოგიურ პროცესს, როგორიცაა უჯრედის ციკლის პროგრესირება და უჯრედების დიფერენციაცია p2742 ტრანსკრიპციის გააქტიურების გზით.
დასასრულს, ჩვენ გვჯერა, რომ ეგზოსომური miR-21, რომელიც მიღებულია ტოქსოპლაზმით ინფიცირებული მიკროგლიიდან, შეიძლება ითამაშოს მნიშვნელოვანი როლი, როგორც გლიომის უჯრედების ზრდის რეგულატორი (ნახ. 7).თუმცა, საჭიროა შემდგომი კვლევები ეგზოსომურ miR-21-ის, შეცვლილი ტოქსოპლაზმის ინფექციასა და გლიომის ზრდას შორის პირდაპირი კავშირის მოსაძებნად.მოსალოდნელია, რომ ეს შედეგები იქნება საწყისი წერტილი ტოქსოპლაზმის ინფექციასა და გლიომის სიხშირეს შორის კავშირის შესასწავლად.
ამ კვლევაში შემოთავაზებულია გლიომის (ტვინის) კარცინოგენეზის მექანიზმის სქემატური დიაგრამა.ავტორი ხატავს PowerPoint 2019-ში (Microsoft, Redmond, WA).
ყველა ექსპერიმენტული პროტოკოლი ამ კვლევაში, ცხოველების გამოყენების ჩათვლით, შეესაბამებოდა სეულის ეროვნული უნივერსიტეტის ცხოველთა მოვლისა და მომხმარებლის კომიტეტის სტანდარტულ ეთიკურ გაიდლაინებს და დამტკიცებული იყო სეულის ეროვნული უნივერსიტეტის მედიცინის სკოლის ინსტიტუციური განხილვის საბჭოს მიერ (IRB ნომერი SNU- 150715).-2).ყველა ექსპერიმენტული პროცედურა ჩატარდა ARRIVE რეკომენდაციების შესაბამისად.
BV2 თაგვის მიკროგლია და U87 ადამიანის გლიომის უჯრედები კულტივირებული იყო Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) და Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), შესაბამისად, თითოეული შეიცავდა 10% ნაყოფის მსხვილფეხა რქოსანი შრატს, 4 მმლ. გლუტამინი, 0,2 მმ პენიცილინი და 0,05 მმ სტრეპტომიცინი.უჯრედები კულტივირებული იყო ინკუბატორში 5% CO2-ით 37°C-ზე.გლიომის სხვა უჯრედული ხაზი, U118, გამოიყენებოდა U87 უჯრედებთან შესადარებლად.
T. gondii-ით ინფიცირებული RH და ME49 შტამებიდან ეგზოზომების გამოსაყოფად, T. gondii ტაქიზოიტები (RH შტამი) ამოღებულ იქნა 6 კვირის BALB/c თაგვების მუცლის ღრუდან, რომლებსაც გაუკეთეს 3-4 დღით ადრე.ტაქიზოიტები სამჯერ გარეცხეს PBS-ით და გაიწმინდეს ცენტრიფუგირებით 40%-იან პერკოლში (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.ME49 შტამის ტაქიზოიტების მისაღებად, BALB/c თაგვებს ინტრაპერიტონეულად გაუკეთეს 20 ქსოვილის ცისტა და ტაქიზოიტის ტრანსფორმაცია ცისტებში შეგროვდა მუცლის ღრუს დაბანით ინფიცირებიდან მე-6-8 დღეს (PI).PBS-ით ინფიცირებული თაგვები.ME49 ტაქიზოიტები გაიზარდა უჯრედებში, რომლებსაც დაემატა 100 μg/ml პენიცილინი (Gibco/BRL, Grand Island, NY, აშშ), 100 μg/ml სტრეპტომიცინი (Gibco/BRL) და 5% ნაყოფის მსხვილფეხა რქოსანი შრატი (Lonza, Walkersville, MD) .., აშშ) 37 °C და 5% ნახშირორჟანგი.ვეროს უჯრედებში გაშენების შემდეგ, ME49 ტაქიზოიტები ორჯერ გაიარეს 25 დიამეტრის ნემსით და შემდეგ 5 მკმ ფილტრის მეშვეობით ნამსხვრევებისა და უჯრედების მოსაშორებლად.გარეცხვის შემდეგ, ტაქიზოიტები ხელახლა შეჩერდა PBS44-ში.Toxoplasma gondii შტამის ME49 ქსოვილის ცისტები შენარჩუნებული იყო ინფიცირებული C57BL/6 თაგვების ტვინიდან გამოყოფილი კისტების ინტრაპერიტონეალური ინექციით (Orient Bio Animal Center, Seongnam, კორეა).ME49-ით ინფიცირებული თაგვების ტვინი ამოიღეს PI-დან 3 თვის შემდეგ და დაკეპილი მიკროსკოპის ქვეშ ცისტების გამოსაყოფად.ინფიცირებული თაგვები სეულის ეროვნული უნივერსიტეტის მედიცინის სკოლაში სპეციალურ პათოგენისგან თავისუფალ პირობებში (SPF) ინახებოდა.
მთლიანი რნმ ამოღებულია BV2-დან მიღებული ეგზოსომებიდან, BV2 უჯრედებიდან და ქსოვილებიდან miRNeasy Mini Kit-ის გამოყენებით (Qiagen, Hilden, გერმანია) მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით, ელუციის საფეხურის ინკუბაციის დროის ჩათვლით.რნმ-ის კონცენტრაცია განისაზღვრა NanoDrop 2000 სპექტროფოტომეტრზე.რნმ-ის მიკრომასივების ხარისხი შეფასდა Agilent 2100 ბიოანალიზატორის გამოყენებით (Agilent Technologies, Amstelveen, ნიდერლანდები).
DMEM 10% ეგზოზომით ღარიბი FBS-ით მომზადდა ულტრაცენტრიფუგაციით 100,000გრ-ზე 16 საათის განმავლობაში 4°C-ზე და გაფილტრული იყო 0.22 მკმ ფილტრის მეშვეობით (Nalgene, Rochester, NY, USA).BV2 უჯრედები, 5 × 105, კულტივირებული იყო DMEM-ში, რომელიც შეიცავს 10% ეგზოზომით დაცლილი FBS და 1% ანტიბიოტიკები 37°C-ზე და 5% CO2.ინკუბაციიდან 24 საათის შემდეგ, შტამების RH ან ME49 (MOI = 10) ტაქიზოიტები დაემატა უჯრედებს და არა შემოჭრილი პარაზიტები ამოღებულ იქნა ერთი საათის განმავლობაში და ხელახლა შეივსო DMEM-ით.BV2 უჯრედებიდან ეგზოსომა იზოლირებული იყო მოდიფიცირებული დიფერენციალური ცენტრიფუგაციით, ყველაზე ფართოდ გამოყენებული მეთოდით.ხელახლა შეაჩერეთ ეგზოსომის მარცვლები 300 μl PBS-ში რნმ-ის ან ცილის ანალიზისთვის.იზოლირებული ეგზოსომების კონცენტრაცია განისაზღვრა BCA ცილის ანალიზის ნაკრების (Pierce, Rockford, IL, USA) და NanoDrop 2000 სპექტროფოტომეტრის გამოყენებით.
BV2 უჯრედების ნალექები ან BV2-დან მიღებული ეგზოსომები ლიზირებული იყო PRO-PREP™ პროტეინის ექსტრაქციის ხსნარში (iNtRon Biotechnology, Seongnam, კორეა) და ცილები ჩატვირთეს Coomassie-ის ბრწყინვალე ლურჯი შეღებილ 10% SDS პოლიაკრილამიდის გელებზე.გარდა ამისა, ცილები გადაიტანეს PVDF მემბრანებში 2 საათის განმავლობაში.Western blots დადასტურებული იქნა Alix ანტისხეულის (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) გამოყენებით, როგორც ეგზოსომური მარკერი.HRP-კონიუგირებული თხის საწინააღმდეგო თაგვის IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, აშშ) და LAS-1000 პლუს luminescent image ანალიზატორი (Fuji Photographic Film, ტოკიო, იაპონია) გამოყენებული იყო მეორად ანტისხეულად..ჩატარდა გადამცემი ელექტრონული მიკროსკოპია ეგზოსომების ზომისა და მორფოლოგიის შესასწავლად.BV2 უჯრედებიდან გამოყოფილი ეგზოსომები (6.40 მკგ/მკლ) მომზადდა ნახშირბადით დაფარულ ბადეებზე და უარყოფითად შეღებეს 2% ურანილის აცეტატით 1 წუთის განმავლობაში.მომზადებული ნიმუშები დაფიქსირდა 80 კვ აჩქარების ძაბვაზე JEOL 1200-EX II-ის (ტოკიო, იაპონია) გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილია ES1000W Erlangshen CCD კამერით (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
BV2-დან მიღებული ეგზოზომები შეღებილი იყო PKH26 წითელი ფლუორესცენტური დამაკავშირებელი ნაკრების გამოყენებით (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 15 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.U87 უჯრედები, 2×105, PKH26-ის მარკირებული ეგზოსომებით (წითელი) ან ეგზოსომების გარეშე, როგორც უარყოფითი კონტროლი, ინკუბირებული იყო 37°C-ზე 24 საათის განმავლობაში 5% CO2 ინკუბატორში.U87 უჯრედის ბირთვები შეღებილ იქნა DAPI-ით (ლურჯი), U87 უჯრედები დაფიქსირდა 4% პარაფორმალდეჰიდში 15 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე და შემდეგ გაანალიზდა Leica TCS SP8 STED CW კონფოკალური მიკროსკოპის სისტემაში (Leica Microsystems, Mannheim, გერმანია).დაკვირვებადი.
cDNA სინთეზირებული იყო siRNA-დან Mir-X siRNA პირველი ჯაჭვის სინთეზისა და SYBR qRT-PCR ნაკრების გამოყენებით (Takara Bio Inc., Shiga, იაპონია).რეალურ დროში რაოდენობრივი PCR ჩატარდა iQ5 რეალურ დროში PCR გამოვლენის სისტემის გამოყენებით (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) SYBR Premix-თან შერეული პრაიმერებისა და შაბლონების გამოყენებით.დნმ გაძლიერდა დენატურაციის 40 ციკლისთვის 95°C-ზე 15 წამის განმავლობაში და ანილირება 60°C-ზე 60 წამის განმავლობაში.თითოეული PCR რეაქციის მონაცემები გაანალიზებული იყო iQ™5 ოპტიკური სისტემის პროგრამული უზრუნველყოფის (Bio-Rad) მონაცემთა ანალიზის მოდულის გამოყენებით.შედარებითი ცვლილებები გენის ექსპრესიაში შერჩეულ სამიზნე გენებსა და β-აქტინს/siRNA-ს (და U6-ს) შორის გამოთვლილი იყო სტანდარტული მრუდის მეთოდის გამოყენებით.გამოყენებული პრაიმერის თანმიმდევრობა ნაჩვენებია ცხრილში 1.
3 x 104 U87 გლიომის უჯრედი დათესეს 96 ჭაბურღილიან თეფშებში და შერეული იქნა ტოქსოპლაზმით ინფიცირებულ ეგზოსომებთან, რომლებიც მიიღება BV2-დან (50 მკგ/მლ) ან არაპულსური ეგზოსომებით, რომლებიც მიიღება BV2-დან (50 მკგ/მლ), როგორც კონტროლი 12, 18 და 36 საათში. .უჯრედების პროლიფერაციის სიჩქარე განისაზღვრა უჯრედების დათვლის ნაკრები-8-ის გამოყენებით (დოჯინდო, კუმამოტო, იაპონია) (დამატებითი ფიგურები S1-S3) 46 .
5 კვირის მდედრი BALB/c შიშველი თაგვები შეძენილი იქნა Orient Bio-დან (Seongnam-si, სამხრეთ კორეა) და ინდივიდუალურად ინახებოდა სტერილურ გალიებში ოთახის ტემპერატურაზე (22±2°C) და ტენიანობაზე (45±15°C).%) ოთახის ტემპერატურაზე (22±2°C) და ტენიანობაზე (45±15%).12-საათიანი სინათლის ციკლი და 12-საათიანი ბნელი ციკლი ჩატარდა SPF-ის (სეულის ეროვნული უნივერსიტეტის მედიცინის სკოლის ცხოველთა ცენტრი) ქვეშ.თაგვები შემთხვევით დაყვეს სამ ჯგუფად თითო 5 თაგვისგან და ყველა ჯგუფს გაუკეთეს კანქვეშა ინექცია 400 მლ PBS, რომელიც შეიცავდა 1 x 107 U87 გლიომის უჯრედებს და ზრდის ფაქტორის შემცირებულ BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, USA).სიმსივნის ინექციიდან ექვსი დღის შემდეგ, 200 მგ ეგზოსომა, მიღებული BV2 უჯრედებიდან (ტოქსოპლაზმის ინფექციით/გარეშე) შეიყვანეს სიმსივნის ადგილას.სიმსივნის ინფექციიდან ოცდაორი დღის შემდეგ, თითოეულ ჯგუფში თაგვების სიმსივნის ზომა გაზომეს კალიბრით კვირაში სამჯერ და სიმსივნის მოცულობა გამოითვალა ფორმულით: 0,5×(სიგანე)×2×სიგრძე.
მიკრორნმ-ის გამოხატვის ანალიზი miRCURYTM LNA miRNA მასივის გამოყენებით, მე-7 თაობას აქვს mmu და rno მასივები (EXIQON, Vedbaek, დანია), რომელიც მოიცავს 1119 კარგად დახასიათებულ თაგვს 3100 ადამიანის, თაგვისა და ვირთხის მირნმ-ის დაჭერის ზონდს შორის.ამ პროცედურის დროს, 250-დან 1000 ნგამდე მთლიანი რნმ ამოღებულ იქნა 5'-ფოსფატიდან ხბოს ნაწლავის ტუტე ფოსფატაზას დამუშავებით, რასაც მოჰყვა მარკირება Hy3 მწვანე ფლუორესცენტური საღებავით.შემდეგ ეტიკეტირებული ნიმუშები ჰიბრიდიზებული იქნა მიკრომასივების სლაიდების ჩატვირთვით ჰიბრიდიზაციის კამერის ნაკრების (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, აშშ) და ჰიბრიდიზაციის სლაიდების ნაკრების (Agilent Technologies) გამოყენებით.ჰიბრიდიზაცია ტარდებოდა 16 საათის განმავლობაში 56°C ტემპერატურაზე, შემდეგ მიკრომასივები გაირეცხა მწარმოებლის რეკომენდაციების შესაბამისად.დამუშავებული მიკრომასივების სლაიდები შემდეგ სკანირებულ იქნა Agilent G2565CA მიკრომაიჯის სკანერის სისტემის გამოყენებით (Agilent Technologies).სკანირებული სურათები იმპორტირებული იყო Agilent Feature Extraction პროგრამული უზრუნველყოფის ვერსიის 10.7.3.1 (Agilent Technologies) გამოყენებით და თითოეული სურათის ფლუორესცენციის ინტენსივობა რაოდენობრივად განისაზღვრა შეცვლილი Exiqon პროტოკოლის შესაბამისი GAL ფაილის გამოყენებით.მიმდინარე კვლევისთვის მიკროსარეის მონაცემები დეპონირებულია GEO მონაცემთა ბაზაში დაშვების ნომრით GPL32397.
ტოქსოპლაზმით ინფიცირებული RH ან ME49 შტამების მიკროგლიებში მომწიფებული ეგზოსომური miRNA-ების გამოხატვის პროფილები გაანალიზებული იყო სხვადასხვა ქსელური ხელსაწყოების გამოყენებით.სიმსივნის განვითარებასთან დაკავშირებული miRNAs იდენტიფიცირებული იყო miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) გამოყენებით და გაფილტრული იქნა ნორმალიზებული სიგნალის ინტენსივობით (log2) 8.0-ზე მეტი.miRNA-ებს შორის, დიფერენციალურად გამოხატული miRNAs აღმოჩნდა 1,5-ჯერ მეტი შეცვლილი miRNA-ების ფილტრის ანალიზით, შეცვლილი RH ან ME49 შტამებით, რომლებიც ინფიცირებულია T. gondii.
უჯრედები დათესეს ექვს ჭაბურღილიან ფირფიტებში (3 x 105 უჯრედი/ჭა) opti-MEM-ში (Gibco, Carlsbad, CA, აშშ) Lipofectamine 2000-ის გამოყენებით (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).ტრანსფექტირებული უჯრედები კულტივირებული იყო 6 საათის განმავლობაში და შემდეგ გარემო გადაკეთდა ახალ სრულ გარემოში.უჯრედები აღებული იქნა ტრანსფექციის შემდეგ 24 საათის შემდეგ.
სტატისტიკური ანალიზი ძირითადად განხორციელდა Student's t-ტესტით Excel პროგრამული უზრუნველყოფით (Microsoft, Washington, DC, USA).ცხოველთა ექსპერიმენტული ანალიზისთვის, ორმხრივი ANOVA ჩატარდა Prism 3.0 პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). P-მნიშვნელობები < 0.05 ჩაითვალა სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი. P-მნიშვნელობები < 0,05 ჩაითვალა სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P მნიშვნელობები <0.05 ჩაითვალა სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义. P 值< 0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P მნიშვნელობები <0.05 ჩაითვალა სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი.
ამ კვლევაში გამოყენებული ყველა ექსპერიმენტული პროტოკოლი დამტკიცებული იყო სეულის ეროვნული უნივერსიტეტის მედიცინის სკოლის ინსტიტუციური მიმოხილვის საბჭოს მიერ (IRB ნომერი SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.კიბოს გლობალური სიხშირე და სიკვდილიანობა 2018 წელს: GLOBOCAN წყაროები და მეთოდები.ინტერპრეტაცია.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
რაშიდი, ს., რეჰმანი, კ. რაშიდი, ს., რეჰმანი, კ.რაშიდი, ს., რეჰმანი, კ. და აკაში, MS ტვინის სიმსივნეების რისკ-ფაქტორების მიმოხილვა და ძირითადი თერაპიული ჩარევები. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS ტვინის სიმსივნის რისკის ფაქტორების ღრმა გაგება და თერაპიული ჩარევები.რაშიდი, ს., რეჰმანი, კ. და აკაში, MS ტვინის სიმსივნეების რისკ-ფაქტორების მიმოხილვა და ძირითადი თერაპიული ჩარევები.Ბიოსამედიცინო მეცნიერება.ფარმაცევტი.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. ბაქტერიულ-ვირუსული ურთიერთქმედება ადამიანის საჭმლის მომნელებელი და ქალის სასქესო ტრაქტის კიბოებში: ეპიდემიოლოგიური და ლაბორატორიული მტკიცებულებების შეჯამება. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. ბაქტერიულ-ვირუსული ურთიერთქმედება ადამიანის საჭმლის მომნელებელი და ქალის სასქესო ტრაქტის კიბოებში: ეპიდემიოლოგიური და ლაბორატორიული მტკიცებულებების შეჯამება.Kato I., Zhang J. და Sun J. ბაქტერიულ-ვირუსული ურთიერთქმედება ადამიანის კუჭ-ნაწლავის ტრაქტისა და ქალის სასქესო ტრაქტის კიბოს დროს: ეპიდემიოლოგიური და ლაბორატორიული მონაცემების შეჯამება. კატო, ი., ჟანგ, ჯ. და სან, ჯ.据总结. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. ბაქტერიო-ვირუსული ურთიერთქმედება ადამიანის პირის ღრუს საჭმლის მონელებაში და ქალის რეპროდუქციულ ტრაქტში: პოპულარული დაავადების მეცნიერებისა და ლაბორატორიული მტკიცებულებების შეჯამება.Kato I., Zhang J. და Sun J. ბაქტერიულ-ვირუსული ურთიერთქმედება ადამიანის კუჭ-ნაწლავის კიბოსა და ქალის სასქესო ორგანოების კიბოს დროს: ეპიდემიოლოგიური და ლაბორატორიული მონაცემების შეჯამება.კიბო 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL ინფექციიდან კიბომდე: როგორ ცვლის დნმ-ის სიმსივნური ვირუსები მასპინძელი უჯრედის ცენტრალურ ნახშირბადს და ლიპიდურ მეტაბოლიზმს. Magon, KL & Parish, JL ინფექციიდან კიბომდე: როგორ ცვლის დნმ-ის სიმსივნური ვირუსები მასპინძელი უჯრედის ცენტრალურ ნახშირბადს და ლიპიდურ მეტაბოლიზმს.Mahon, KL და Parish, JL ცეცხლის ინფექცია კიბოსკენ: როგორ ცვლის დნმ-ზე დაფუძნებული სიმსივნური ვირუსები მასპინძელი უჯრედის ცენტრალურ ნახშირბადს და ლიპიდურ მეტაბოლიზმს. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢 Magon, KL & Parish, JL ინფექციიდან კიბომდე: როგორ ცვლის დნმ-ის სიმსივნური ვირუსები მასპინძელი უჯრედის ცენტრალურ ნახშირბადს და ლიპიდურ მეტაბოლიზმს.Mahon, KL და Parish, JL ავრცელებს ინფექციას კიბოს: როგორ ცვლის დნმ-ის სიმსივნური ვირუსები ცენტრალურ ნახშირბადს და ლიპიდურ მეტაბოლიზმს მასპინძელ უჯრედებში.ღია ბიოლოგია.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.შისტოსომების კატექოლური ესტროგენები და ღვიძლის ლაქები და ჰელმინთებთან ასოცირებული კიბო.წინა.შიგნით ცხელი.5, 444 (2014).