გმადლობთ Nature.com-ის მონახულებისთვის.ბრაუზერის ვერსიას, რომელსაც იყენებთ, აქვს შეზღუდული CSS მხარდაჭერა.საუკეთესო გამოცდილებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში).იმავდროულად, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ გამოვიყვანთ საიტს სტილის და JavaScript-ის გარეშე.
ფილტვის კისტოზური ფიბროზის სამკურნალო გენის ვექტორები უნდა იყოს მიმართული გამტარ სასუნთქი გზებისკენ, რადგან პერიფერიულ ფილტვთა ტრანსდუქციას არ აქვს თერაპიული ეფექტი.ვირუსული ტრანსდუქციის ეფექტურობა პირდაპირ კავშირშია გადამზიდავის ყოფნის დროზე.თუმცა, მიწოდების სითხეები, როგორიცაა გენის მატარებლები, ბუნებრივად დიფუზირდება ალვეოლებში ინჰალაციის დროს და ნებისმიერი ფორმის თერაპიული ნაწილაკები სწრაფად მოიხსნება ლორწოვანის ტრანსპორტით.სასუნთქ გზებში გენის მატარებლების ბინადრობის დროის გახანგრძლივება მნიშვნელოვანია, მაგრამ ძნელად მისაღწევი.გადამზიდავ-კონიუგირებული მაგნიტური ნაწილაკები, რომლებიც შეიძლება იყოს მიმართული სასუნთქი გზების ზედაპირზე, შეუძლიათ გააუმჯობესონ რეგიონალური დამიზნება.in vivo გამოსახულების პრობლემების გამო, ასეთი მცირე მაგნიტური ნაწილაკების ქცევა სასუნთქი გზების ზედაპირზე გამოყენებული მაგნიტური ველის არსებობისას ცუდად არის გაგებული.ამ კვლევის მიზანი იყო სინქროტრონის გამოსახულების გამოყენება, რათა ვიზუალურად გამოეჩინა მაგნიტური ნაწილაკების სერიის მოძრაობა ანესთეზირებული ვირთხების ტრაქეაში, რათა შესწავლილიყო ცალკეული და ნაყარი ნაწილაკების დინამიკა და ქცევის ნიმუშები in vivo.შემდეგ ჩვენ ასევე შევაფასეთ, გაზრდის თუ არა ლენტივირუსული მაგნიტური ნაწილაკების მიწოდება მაგნიტური ველის თანდასწრებით ვირთხის ტრაქეაში ტრანსდუქციის ეფექტურობას.სინქროტრონის რენტგენის გამოსახულება აჩვენებს მაგნიტური ნაწილაკების ქცევას სტაციონარულ და მოძრავ მაგნიტურ ველებში in vitro და in vivo.ნაწილაკების ადვილად გადატანა ცოცხალი სასუნთქი გზების ზედაპირზე მაგნიტების გამოყენებით შეუძლებელია, მაგრამ ტრანსპორტირების დროს დეპოზიტები კონცენტრირდება ხედვის ველში, სადაც მაგნიტური ველი ყველაზე ძლიერია.ტრანსდუქციის ეფექტურობა ასევე გაიზარდა ექვსჯერ, როდესაც ლენტივირუსული მაგნიტური ნაწილაკები მიეწოდება მაგნიტური ველის თანდასწრებით.ერთად აღებული, ეს შედეგები ვარაუდობს, რომ ლენტივირუსული მაგნიტური ნაწილაკები და მაგნიტური ველები შეიძლება იყოს ღირებული მიდგომები გენის ვექტორის დამიზნებისა და ტრანსდუქციის დონის გასაუმჯობესებლად გამტარ სასუნთქ გზებში in vivo.
კისტოზური ფიბროზი (CF) გამოწვეულია ერთი გენის ვარიაციებით, რომელსაც ეწოდება CF ტრანსმემბრანული გამტარობის რეგულატორი (CFTR).CFTR ცილა არის იონური არხი, რომელიც იმყოფება მრავალი ეპითელური უჯრედის მთელ სხეულში, მათ შორის სასუნთქ გზებში, კისტოზური ფიბროზის პათოგენეზში.CFTR-ის დეფექტები იწვევს წყლის არანორმალურ ტრანსპორტირებას, სასუნთქი გზების ზედაპირის დეჰიდრატაციას და სასუნთქი გზების ზედაპირის სითხის ფენის (ASL) სიღრმის შემცირებას.ის ასევე აზიანებს მუკოცილიარული სატრანსპორტო სისტემის (MCT) უნარს, გაასუფთავოს სასუნთქი გზები ჩასუნთქული ნაწილაკებისა და პათოგენებისგან.ჩვენი მიზანია შევიმუშაოთ ლენტივირუსული (LV) გენური თერაპია CFTR გენის სწორი ასლის მიწოდებისთვის და ASL, MCT და ფილტვების ჯანმრთელობის გასაუმჯობესებლად, და გავაგრძელოთ ახალი ტექნოლოგიების განვითარება, რომლებსაც შეუძლიათ ამ პარამეტრების გაზომვა in vivo1.
LV ვექტორები არის კისტოზური ფიბროზის გენური თერაპიის ერთ-ერთი წამყვანი კანდიდატი, ძირითადად იმიტომ, რომ მათ შეუძლიათ თერაპიული გენის სამუდამოდ ინტეგრირება სასუნთქი გზების ბაზალურ უჯრედებში (სასუნთქი გზების ღეროვანი უჯრედები).ეს მნიშვნელოვანია, რადგან მათ შეუძლიათ აღადგინონ ნორმალური ჰიდრატაცია და ლორწოს კლირენსი დიფერენცირებით სასუნთქი გზების ფუნქციური გენით კორექტირებულ უჯრედებად, რომლებიც ასოცირდება კისტოზურ ფიბროზთან, რაც იწვევს სიცოცხლის ხანგრძლივობას.LV ვექტორები უნდა იყოს მიმართული გამტარ სასუნთქი გზების წინააღმდეგ, რადგან სწორედ აქ იწყება ფილტვების ჩართვა CF-ში.ფილტვებში ვექტორის ღრმად მიწოდებამ შეიძლება გამოიწვიოს ალვეოლური ტრანსდუქცია, მაგრამ ამას არ აქვს თერაპიული ეფექტი კისტოზური ფიბროზის დროს.თუმცა, სითხეები, როგორიცაა გენის მატარებლები, ბუნებრივად მიგრირებენ ალვეოლებში მშობიარობის შემდეგ ჩასუნთქვისას3,4 და თერაპიული ნაწილაკები სწრაფად გამოიდევნება პირის ღრუში MCT-ებით.LV ტრანსდუქციის ეფექტურობა პირდაპირ კავშირშია იმ დროის ხანგრძლივობასთან, როდესაც ვექტორი რჩება სამიზნე უჯრედებთან ახლოს, რათა მოხდეს უჯრედული ათვისება - „რეზიდენციის დრო“ 5, რომელიც ადვილად მცირდება ტიპიური რეგიონალური ჰაერის ნაკადით, ასევე ლორწოს და MCT ნაწილაკების კოორდინირებული შეთვისებით.კისტოზური ფიბროზისთვის, სასუნთქ გზებში LV რეზიდენციის დროის გახანგრძლივების შესაძლებლობა მნიშვნელოვანია ამ ზონაში ტრანსდუქციის მაღალი დონის მისაღწევად, მაგრამ აქამდე იყო გამოწვევა.
ამ დაბრკოლების დასაძლევად, ჩვენ ვთავაზობთ, რომ LV მაგნიტურ ნაწილაკებს (MPs) შეუძლიათ დახმარება ორი დამატებითი გზით.პირველ რიგში, მათ შეუძლიათ იხელმძღვანელონ მაგნიტით სასუნთქი გზების ზედაპირზე, რათა გააუმჯობესონ დამიზნება და დაეხმარონ გენის გადამტან ნაწილაკებს სასუნთქი გზების სწორ მიდამოში ყოფნაში;და ASL) გადადის უჯრედის ფენაში 6. MPs ფართოდ გამოიყენება, როგორც წამლის მიწოდების მიზანმიმართული საშუალება, როდესაც ისინი აკავშირებენ ანტისხეულებს, ქიმიოთერაპიულ პრეპარატებს ან სხვა მცირე მოლეკულებს, რომლებიც მიმაგრებულია უჯრედის მემბრანებთან ან უკავშირდება მათ უჯრედის ზედაპირის შესაბამის რეცეპტორებს და გროვდება სიმსივნის უბნებზე. სტატიკური ელექტროენერგიის არსებობა.მაგნიტური ველები კიბოს თერაპიისთვის 7. სხვა „ჰიპერთერმული“ მეთოდები მიზნად ისახავს სიმსივნური უჯრედების მოკვლას დეპუტატების გაცხელებით, რხევადი მაგნიტური ველების ზემოქმედებისას.მაგნიტური ტრანსფექციის პრინციპი, რომლის დროსაც მაგნიტური ველი გამოიყენება ტრანსფექციის აგენტად უჯრედებში დნმ-ის გადაცემის გასაძლიერებლად, ჩვეულებრივ გამოიყენება in vitro არავირუსული და ვირუსული გენის ვექტორების დიაპაზონის გამოყენებით რთულად გადასატანი უჯრედული ხაზებისთვის. ..დადგინდა LV მაგნიტოტრანსფექციის ეფექტურობა LV MP-ის in vitro მიწოდებით ადამიანის ბრონქული ეპითელიუმის უჯრედულ ხაზში სტატიკური მაგნიტური ველის თანდასწრებით, რაც ზრდის ტრანსდუქციის ეფექტურობას 186-ჯერ მხოლოდ LV ვექტორთან შედარებით.LV MT ასევე გამოიყენებოდა კისტოზური ფიბროზის ინ ვიტრო მოდელზე, სადაც მაგნიტურმა ტრანსფექციამ გაზარდა LV ტრანსდუქცია ჰაერ-თხევადი ინტერფეისის კულტურებში 20-ჯერ, კისტოზური ფიბროზის ნახველის არსებობისას.თუმცა, in vivo ორგანოს მაგნიტოტრანსფექციას მიექცა შედარებით მცირე ყურადღება და შეფასებული იყო მხოლოდ რამდენიმე ცხოველურ კვლევაში11,12,13,14,15, განსაკუთრებით ფილტვებში16,17.თუმცა, კისტოზური ფიბროზის დროს ფილტვების თერაპიაში მაგნიტური ტრანსფექციის შესაძლებლობები ნათელია.თან და სხვ.(2020) განაცხადა, რომ „მაგნიტური ნანონაწილაკების ეფექტური ფილტვის მიწოდების ვალიდაციის კვლევა გზას გაუხსნის CFTR ინჰალაციის სამომავლო სტრატეგიებს კისტოზური ფიბროზის მქონე პაციენტებში კლინიკური შედეგების გასაუმჯობესებლად“6.
მცირე მაგნიტური ნაწილაკების ქცევა სასუნთქი გზების ზედაპირზე გამოყენებული მაგნიტური ველის თანდასწრებით რთულია ვიზუალიზაცია და შესწავლა და, შესაბამისად, ისინი ცუდად არის გაგებული.სხვა კვლევებში, ჩვენ შევიმუშავეთ სინქროტრონის გავრცელებაზე დაფუძნებული ფაზის კონტრასტული რენტგენის გამოსახულების (PB-PCXI) მეთოდი არაინვაზიური ვიზუალიზაციისთვის და ASL18 სიღრმეში და MCT19 ქცევის წუთიერი in vivo ცვლილებების რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის,20 გაზის არხის ზედაპირის ჰიდრატაციის პირდაპირ გასაზომად. და გამოიყენება როგორც მკურნალობის ეფექტურობის ადრეული მაჩვენებელი.გარდა ამისა, ჩვენი MCT ქულების მეთოდი იყენებს 10-35 მკმ დიამეტრის ნაწილაკებს, რომლებიც შედგენილია ალუმინის ან მაღალი რეფრაქციული ინდექსის შუშისგან, როგორც MCT მარკერები, რომლებიც ჩანს PB-PCXI21-ით.ორივე მეთოდი შესაფერისია სხვადასხვა ტიპის ნაწილაკების გამოსახულების მისაღებად, მათ შორის MPs.
მაღალი სივრცითი და დროითი გარჩევადობის გამო, ჩვენი PB-PCXI-ზე დაფუძნებული ASL და MCT ანალიზები კარგად შეეფერება ცალკეული და ნაყარი ნაწილაკების დინამიკისა და ქცევის შაბლონების შესასწავლად in vivo, რათა დაგვეხმაროს გავიგოთ და გავაუმჯობესოთ MP გენის მიწოდების მეთოდები.მიდგომა, რომელსაც აქ ვიყენებთ, ეფუძნება ჩვენს კვლევებს SPring-8 BL20B2 სხივის გამოყენებით, რომელშიც ჩვენ ვიზუალურად ვაჩვენეთ სითხის მოძრაობა თაგვების ცხვირისა და ფილტვის სასუნთქ გზებში მოჩვენებითი ვექტორის დოზის მიწოდების შემდეგ, რათა დაგვეხმაროს ახსნას ჩვენი ჰეტეროგენული გენის ექსპრესიის შაბლონები. ჩვენს გენში.ცხოველების კვლევები გადამზიდავი დოზით 3.4.
ამ კვლევის მიზანი იყო PB-PCXI სინქროტრონის გამოყენება ცოცხალი ვირთხების ტრაქეაში დეპუტატების სერიის in vivo მოძრაობების ვიზუალიზაციისთვის.ეს PB-PCXI გამოსახულების კვლევები შექმნილია MP სერიის, მაგნიტური ველის სიძლიერისა და მდებარეობის შესამოწმებლად, რათა დადგინდეს მათი გავლენა MP მოძრაობაზე.ჩვენ ვივარაუდეთ, რომ გარე მაგნიტური ველი დაეხმარებოდა მიწოდებულ MF-ს დარჩენაში ან გადაადგილებაში სამიზნე ზონაში.ამ კვლევებმა ასევე მოგვცა საშუალება დაგვედგინა მაგნიტის კონფიგურაციები, რომლებიც მაქსიმალურად გაზრდის ნაწილაკების რაოდენობას ტრაქეაში დეპონირების შემდეგ.კვლევების მეორე სერიაში ჩვენ მიზნად ისახავდა გამოგვეყენებინა ეს ოპტიმალური კონფიგურაცია ვირთხის სასუნთქ გზებში LV-MP-ების მიწოდების შედეგად მიღებული ტრანსდუქციის ნიმუშის დემონსტრირებისთვის, იმ ვარაუდით, რომ LV-MP-ების მიწოდება სასუნთქი გზების დამიზნების კონტექსტში გამოიწვევდა LV გადაცემის ეფექტურობის გაზრდაში..
ცხოველებზე ყველა კვლევა ჩატარდა ადელაიდის უნივერსიტეტის (M-2019-060 და M-2020-022) და SPring-8 სინქროტრონის ცხოველთა ეთიკის კომიტეტის მიერ დამტკიცებული პროტოკოლების შესაბამისად.ექსპერიმენტები ჩატარდა ARRIVE-ის რეკომენდაციების შესაბამისად.
ყველა რენტგენის გამოსახულება გადაღებულია BL20XU სხივზე SPring-8 სინქროტრონზე იაპონიაში, ადრე აღწერილის მსგავსი პარამეტრის გამოყენებით21,22.მოკლედ, ექსპერიმენტული ყუთი სინქროტრონის შესანახი რგოლიდან 245 მეტრში მდებარეობდა.ნიმუშიდან დეტექტორამდე მანძილი 0,6 მ გამოიყენება ნაწილაკების გამოსახულების კვლევებისთვის და 0,3 მ in vivo გამოსახულების კვლევებისთვის ფაზის კონტრასტული ეფექტების შესაქმნელად.გამოყენებული იქნა მონოქრომატული სხივი 25 კევ ენერგიით.სურათები შეძენილი იქნა მაღალი გარჩევადობის რენტგენის გადამყვანის (SPring-8 BM3) გამოყენებით, რომელიც დაკავშირებულია sCMOS დეტექტორთან.გადამყვანი რენტგენის სხივებს ხილულ სინათლედ გარდაქმნის 10 მკმ სისქის სკინტილატორის (Gd3Al2Ga3O12) გამოყენებით, რომელიც შემდეგ მიმართულია sCMOS სენსორზე ×10 (NA 0.3) მიკროსკოპის ობიექტის გამოყენებით.sCMOS დეტექტორი იყო Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, იაპონია) მასივის ზომით 2048 × 2048 პიქსელი და ნედლი პიქსელის ზომა 6.5 × 6.5 μm.ეს პარამეტრი იძლევა პიქსელის ეფექტურ იზოტროპულ ზომას 0,51 μm და ხედვის ველს დაახლოებით 1,1 მმ × 1,1 მმ.ექსპოზიციის ხანგრძლივობა 100 ms არჩეული იყო სასუნთქი გზების შიგნით და გარეთ მაგნიტური ნაწილაკების სიგნალ-ხმაურთან თანაფარდობის მაქსიმიზაციის მიზნით, ხოლო სუნთქვით გამოწვეული მოძრაობის არტეფაქტების მინიმუმამდე შემცირება.in vivo კვლევებისთვის, სწრაფი რენტგენის ჩამკეტი განთავსდა რენტგენის გზაზე, რათა შეზღუდოს რადიაციის დოზა რენტგენის სხივის დაბლოკვით ექსპოზიციებს შორის.
LV მედია არ იყო გამოყენებული SPring-8 PB-PCXI ვიზუალიზაციის კვლევებში, რადგან BL20XU გამოსახულების კამერა არ არის ბიოუსაფრთხოების მე-2 დონის სერტიფიცირებული.ამის ნაცვლად, ჩვენ შევარჩიეთ კარგად დახასიათებული დეპუტატების დიაპაზონი ორი კომერციული გამყიდველისგან, რომლებიც მოიცავს ზომების, მასალების, რკინის კონცენტრაციისა და გამოყენების დიაპაზონს - ჯერ იმის გასაგებად, თუ როგორ მოქმედებს მაგნიტური ველები დეპუტატების მოძრაობაზე მინის კაპილარებში და შემდეგ ცოცხალი სასუნთქი გზები.ზედაპირი.MP-ის ზომა მერყეობს 0,25-დან 18 μm-მდე და მზადდება სხვადასხვა მასალისგან (იხ. ცხრილი 1), მაგრამ თითოეული ნიმუშის შემადგენლობა, MP-ში მაგნიტური ნაწილაკების ზომის ჩათვლით, უცნობია.ჩვენი ვრცელი MCT კვლევების საფუძველზე 19, 20, 21, 23, 24, ჩვენ მოველით, რომ MPs ქვემოთ 5 μm შეიძლება ნახოთ ტრაქეის სასუნთქი გზების ზედაპირზე, მაგალითად, თანმიმდევრული ჩარჩოების გამოკლებით MP მოძრაობის გაუმჯობესებული ხილვადობის სანახავად.0,25 მკმ-ის ერთი MP არის უფრო მცირე ვიდრე გამოსახულების მოწყობილობის გარჩევადობა, მაგრამ მოსალოდნელია, რომ PB-PCXI აღმოაჩენს მათ მოცულობით კონტრასტს და ზედაპირის სითხის მოძრაობას, რომელზეც ისინი დეპონირდება დეპონირების შემდეგ.
ნიმუშები თითოეული დეპუტატისთვის ცხრილში.1 მომზადდა 20 μl მინის კაპილარებში (Drummond Microcaps, PA, აშშ) შიდა დიამეტრით 0,63 მმ.კორპუსკულური ნაწილაკები ხელმისაწვდომია წყალში, ხოლო CombiMag ნაწილაკები ხელმისაწვდომია მწარმოებლის საკუთრებაში არსებულ სითხეში.თითოეული მილი ნახევრად ივსება სითხით (დაახლოებით 11 μl) და მოთავსებულია ნიმუშის დამჭერზე (იხ. სურათი 1).შუშის კაპილარები ჰორიზონტალურად იყო განთავსებული გამოსახულების კამერაში სცენაზე და განლაგებული იყო სითხის კიდეებზე.19 მმ დიამეტრის (28 მმ სიგრძის) ნიკელის გარსის მაგნიტი, დამზადებული იშვიათი მიწისგან, ნეოდიმისაგან, რკინისა და ბორისგან (NdFeB) (N35, კატ. No. LM1652, Jaycar Electronics, ავსტრალია) 1,17 ტ რემანენტით მიმაგრებული იყო ცალკე გადაცემის ცხრილი, რომ მიაღწიოთ დისტანციურად შეცვალეთ თქვენი პოზიცია რენდერის დროს.რენტგენის გამოსახულება იწყება მაშინ, როდესაც მაგნიტი განლაგებულია ნიმუშიდან დაახლოებით 30 მმ-ზე და გამოსახულება მიიღება 4 კადრი წამში.გამოსახულების დროს, მაგნიტი მიიტანეს მინის კაპილარულ მილთან (დაახლოებით 1 მმ მანძილზე) და შემდეგ გადაადგილდა მილის გასწვრივ ველის სიძლიერის და პოზიციის ეფექტის შესაფასებლად.
ინ ვიტრო გამოსახულების დაყენება, რომელიც შეიცავს MP ნიმუშებს მინის კაპილარებში xy ნიმუშის თარგმნის ეტაპზე.რენტგენის სხივის გზა აღინიშნება წითელი წერტილოვანი ხაზით.
მას შემდეგ, რაც დადგინდა დეპუტატების ინ ვიტრო ხილვადობა, მათი ქვეჯგუფი შემოწმდა in vivo ველური ტიპის მდედრობითი სქესის ალბინოს ვირთხებზე (~12 კვირის, ~200 გ).მედეტომიდინი 0.24 მგ/კგ (Domitor®, Zenoaq, Japan), მიდაზოლამი 3.2 მგ/კგ (Dormicum®, Astellas Pharma, იაპონია) და ბუტორფანოლი 4 მგ/კგ (Vetorphale®, Meiji Seika).ვირთხებს გაუკეთეს ანესთეზირება ფარმას (იაპონია) ნარევით ინტრაპერიტონეალური ინექციით.ანესთეზიის შემდეგ, ისინი მოამზადეს ვიზუალიზაციისთვის ტრაქეის ირგვლივ ბეწვის მოცილებით, ენდოტრაქეალური მილის ჩასმით (ET; 16 Ga ინტრავენური კანულა, Terumo BCT) და მათი იმობილიზაცია მწოლიარე მდგომარეობაში სპეციალურად დამზადებულ ვიზუალიზაციის ფირფიტაზე, რომელიც შეიცავს თერმოჩანთას. სხეულის ტემპერატურის შესანარჩუნებლად.22. გამოსახულების ფირფიტა შემდეგ მიმაგრებული იყო ნიმუშის სტადიაზე გამოსახულების ყუთში მცირე კუთხით, რათა ტრაქეა ჰორიზონტალურად გასწორდეს რენტგენის სურათზე, როგორც ნაჩვენებია სურათზე 2a.
(ა) in vivo გამოსახულების დაყენება SPring-8 ვიზუალიზაციის განყოფილებაში, რენტგენის სხივის გზა აღინიშნება წითელი წერტილოვანი ხაზით.(ბ, გ) ტრაქეის მაგნიტის ლოკალიზაცია განხორციელდა დისტანციურად ორი ორთოგონალურად დამონტაჟებული IP კამერის გამოყენებით.ეკრანზე გამოსახულების მარცხენა მხარეს შეგიძლიათ იხილოთ მავთულის მარყუჟი, რომელსაც უჭირავს თავი და მიწოდების კანულა, რომელიც დამონტაჟებულია ET მილის შიგნით.
დისტანციური მართვის შპრიცის სატუმბი სისტემა (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) 100 μl მინის შპრიცის გამოყენებით, დაკავშირებული იყო PE10 მილთან (0.61 მმ OD, 0.28 მმ ID) 30 Ga ნემსის გამოყენებით.მონიშნეთ მილი, რათა დარწმუნდეთ, რომ წვერი სწორ მდგომარეობაშია ტრაქეაში ენდოტრაქეალური მილის ჩასმისას.მიკროტუმბოს გამოყენებით შპრიცის დგუში ამოიღეს და მილის წვერი ჩაეფლო მიწოდების MP ნიმუშში.დატვირთული მიწოდების მილი შემდეგ ჩასვეს ენდოტრაქეალურ მილში, წვერი მოათავსეს ჩვენი მოსალოდნელი გამოყენებული მაგნიტური ველის უძლიერეს ნაწილზე.გამოსახულების მიღება კონტროლდებოდა სუნთქვის დეტექტორის გამოყენებით, რომელიც დაკავშირებულია ჩვენს Arduino-ზე დაფუძნებულ ტაიმინგის ყუთთან და ყველა სიგნალი (მაგ., ტემპერატურა, სუნთქვა, ჩამკეტის გახსნა/დახურვა და გამოსახულების მიღება) ჩაიწერა Powerlab-ისა და LabChart-ის გამოყენებით (AD Instruments, Sydney, ავსტრალია) 22 გამოსახულების გადაღებისას როდესაც კორპუსი მიუწვდომელია, ორი IP კამერა (Panasonic BB-SC382) განლაგებული იყო დაახლოებით 90°-ზე ერთმანეთის მიმართ და გამოიყენებოდა გამოსახულების დროს მაგნიტის პოზიციის გასაკონტროლებლად ტრაქეასთან მიმართებაში (სურათი 2b, c).მოძრაობის არტეფაქტების შესამცირებლად, თითო სუნთქვაზე ერთი სურათი იქნა მიღებული ტერმინალური რესპირატორული ნაკადის პლატოზე.
მაგნიტი მიმაგრებულია მეორე საფეხურზე, რომელიც შეიძლება დისტანციურად განთავსდეს გამოსახულების სხეულის გარედან.შემოწმებული იქნა მაგნიტის სხვადასხვა პოზიციები და კონფიგურაციები, მათ შორის: მოთავსებულია ტრაქეის ზემოთ დაახლოებით 30° კუთხით (კონფიგურაციები ნაჩვენებია სურათებში 2a და 3a);ერთი მაგნიტი ცხოველის ზემოთ და მეორე ქვემოთ, მიზიდულობისთვის დაყენებული ბოძებით (სურათი 3b)., ერთი მაგნიტი ცხოველის ზემოთ და ერთი ქვემოთ, პოლუსებით დაყენებული მოგერიებისთვის (სურათი 3c) და ერთი მაგნიტი ზემოთ და ტრაქეასთან პერპენდიკულარული (სურათი 3d).ცხოველისა და მაგნიტის დაყენების და ტესტის ქვეშ მყოფი MP-ის შპრიცის ტუმბოში ჩატვირთვის შემდეგ, გამოსახულების მიღებისას მიიტანეთ დოზა 50 μl სიჩქარით 4 მკლ/წმ.შემდეგ მაგნიტი მოძრაობს წინ და უკან ტრაქეის გასწვრივ ან მთელს გასწვრივ, ხოლო სურათების მიღება გრძელდება.
მაგნიტის კონფიგურაცია in vivo გამოსახულებისთვის (ა) ერთი მაგნიტი ტრაქეის ზემოთ დაახლოებით 30° კუთხით, (ბ) ორი მაგნიტი კონფიგურირებული მიზიდულობისთვის, (გ) ორი მაგნიტი კონფიგურირებული მოგერიებისთვის, (დ) ერთი მაგნიტი ზემოთ და პერპენდიკულარული ტრაქეა.დამკვირვებელმა ტრაქეის გავლით პირიდან ფილტვებამდე გაიხედა და რენტგენის სხივი ვირთხის მარცხენა მხარეს გაიარა და მარჯვენა მხრიდან გამოვიდა.მაგნიტი ან მოძრაობს სასუნთქი გზების სიგრძეზე ან ტრაქეის ზემოთ მარცხნივ და მარჯვნივ რენტგენის სხივის მიმართულებით.
ჩვენ ასევე ვცდილობდით განვსაზღვროთ სასუნთქ გზებში ნაწილაკების ხილვადობა და ქცევა სუნთქვისა და გულისცემის შერევის არარსებობის შემთხვევაში.ამიტომ, ვიზუალიზაციის პერიოდის ბოლოს, ცხოველების ადამიანური ევთანაზია ხდებოდა პენტობარბიტალის ჭარბი დოზის გამო (სომნოპენტილი, პიტმან-მური, ვაშინგტონ კროსინგი, აშშ; ~65 მგ/კგ ინ.პ.).ზოგიერთი ცხოველი დარჩა გამოსახულების პლატფორმაზე და სუნთქვისა და გულისცემის შეწყვეტის შემდეგ, ვიზუალიზაციის პროცესი განმეორდა, დაემატა MP-ის დამატებითი დოზა, თუ MP არ ჩანდა სასუნთქი გზების ზედაპირზე.
შედეგად მიღებული სურათები შესწორდა ბრტყელ და ბნელ ველზე და შემდეგ აწყობილი ფილმად (20 კადრი წამში; 15–25 × ნორმალური სიჩქარე სუნთქვის სიხშირეზეა დამოკიდებული) MATLAB-ში დაწერილი პერსონალური სკრიპტის გამოყენებით (R2020a, The Mathworks).
ყველა კვლევა LV გენის ვექტორის მიწოდებაზე ჩატარდა ადელაიდის უნივერსიტეტის ლაბორატორიულ ცხოველთა კვლევის ცენტრში და მიზნად ისახავდა გამოეყენებინათ SPring-8 ექსპერიმენტის შედეგები იმის შესაფასებლად, შეუძლია თუ არა LV-MP მიწოდება მაგნიტური ველის თანდასწრებით გაზარდოს გენის ტრანსფერი in vivo. .MF-ისა და მაგნიტური ველის ეფექტის შესაფასებლად ცხოველთა ორ ჯგუფს მკურნალობდნენ: ერთ ჯგუფს გაუკეთეს LV MF მაგნიტის განლაგებით, ხოლო მეორე ჯგუფს გაუკეთეს საკონტროლო ჯგუფი LV MF მაგნიტის გარეშე.
LV გენის ვექტორები წარმოიქმნება ადრე აღწერილი მეთოდების გამოყენებით 25, 26.LacZ ვექტორი გამოხატავს ბირთვულ ლოკალიზებულ ბეტა-გალაქტოზიდაზას გენს, რომელსაც ამოძრავებს MPSV კონსტიტუციური პრომოტორი (LV-LacZ), რომელიც წარმოქმნის ცისფერ რეაქციის პროდუქტს ტრანსდუცირებულ უჯრედებში, ხილული ფილტვის ქსოვილის ფრონტებზე და მონაკვეთებზე.ტიტრირება განხორციელდა უჯრედულ კულტურებში LacZ-დადებითი უჯრედების რაოდენობის ხელით დათვლით ჰემოციტომეტრის გამოყენებით ტიტრის ტუ/მლ-ში გამოსათვლელად.მატარებლები კრიოკონსერვირებულია -80°C-ზე, დათბობენ გამოყენებამდე და აკავშირებენ CombiMag-ს 1:1 შერევით და ყინულზე ინკუბაციით მიწოდებამდე მინიმუმ 30 წუთით ადრე.
ნორმალური Sprague Dawley ვირთხები (n = 3/ჯგუფი, ~2-3 ანესთეზირებული ip 0.4მგ/კგ მედეტომიდინის (დომიტორი, ილიუმი, ავსტრალია) და 60მგ/კგ კეტამინი (ილიუმი, ავსტრალია) 1 თვის ასაკში) ip ) ინექცია და არაქირურგიული პერორალური კანულაცია 16 Ga ინტრავენური კანულით.იმის უზრუნველსაყოფად, რომ ტრაქეის სასუნთქი გზების ქსოვილი მიიღებს LV ტრანსდუქციას, იგი განპირობებული იყო ჩვენი ადრე აღწერილი მექანიკური აშლილობის პროტოკოლით, რომლის დროსაც ტრაქეის სასუნთქი გზების ზედაპირი ღერძულად იყო გახეხილი მავთულის კალათით (N-წრე, ნიტინოლის ქვის ამომყვანი წვერის გარეშე NTSE-022115) -UDH. Cook Medical, USA) 30 p28.შემდეგ, ბიოუსაფრთხოების კაბინეტში დარღვევიდან დაახლოებით 10 წუთის შემდეგ, ჩატარდა LV-MP-ის ტრაქეალური შეყვანა.
ამ ექსპერიმენტში გამოყენებული მაგნიტური ველი კონფიგურირებული იყო ისევე, როგორც in vivo რენტგენის კვლევა, იგივე მაგნიტები ტრაქეაზე დაჭერილი დისტილაციური სტენტის დამჭერებით (სურათი 4).LV-MP-ის 50 μl მოცულობა (2 x 25 μl ალიკვოტი) მიტანილი იქნა ტრაქეაში (n = 3 ცხოველი) გელის წვერით მოპირკეთებული პიპეტის გამოყენებით, როგორც ეს აღწერილია ადრე.საკონტროლო ჯგუფმა (n = 3 ცხოველი) მიიღო იგივე LV-MP მაგნიტის გამოყენების გარეშე.ინფუზიის დასრულების შემდეგ კანულა ამოღებულია ენდოტრაქეალური მილიდან და ხდება ცხოველის ექსტუბაცია.მაგნიტი რჩება ადგილზე 10 წუთით ადრე ამოღებამდე.ვირთხებს მიიღეს კანქვეშა დოზა მელოქსიკამით (1 მლ/კგ) (ილიუმი, ავსტრალია), რასაც მოჰყვა ანესთეზიის გაუქმება 1 მგ/კგ ატიპამაზოლის ჰიდროქლორიდის ინტრაპერიტონეალური ინექციით (Antisedan, Zoetis, ავსტრალია).ვირთხები ინახებოდა თბილად და აკვირდებოდნენ ანესთეზიისგან სრულ გამოჯანმრთელებამდე.
LV-MP მიწოდების მოწყობილობა ბიოლოგიური უსაფრთხოების კაბინეტში.თქვენ ხედავთ, რომ ET მილის ღია ნაცრისფერი Luer-lock ყდა ამოდის პირიდან და ნახატზე ნაჩვენები გელის პიპეტის წვერი ჩასმულია ET მილის მეშვეობით სასურველ სიღრმემდე ტრაქეაში.
LV-MP შეყვანის პროცედურის შემდეგ ერთი კვირის შემდეგ, ცხოველები ადამიანურად შეიწირეს 100% CO2-ის ინჰალაციის გზით და LacZ-ის ექსპრესია შეფასდა ჩვენი სტანდარტული X-gal მკურნალობის გამოყენებით.სამი ყველაზე კუდალური ხრტილოვანი რგოლი ამოღებულ იქნა, რათა უზრუნველყოფილიყო, რომ ენდოტრაქეალური მილის განთავსების გამო რაიმე მექანიკური დაზიანება ან სითხის შეკავება არ იქნება გათვალისწინებული ანალიზში.თითოეული ტრაქეა იყო გაჭრილი სიგრძეზე, რათა მიეღო ანალიზისთვის ორი ნახევრად და მოთავსებული იქნა თასში, რომელიც შეიცავს სილიკონის რეზინას (Sylgard, Dow Inc) Minutien ნემსის გამოყენებით (Fine Science Tools) სანათური ზედაპირის ვიზუალიზაციისთვის.ტრანსდუცირებული უჯრედების განაწილება და ხასიათი დადასტურდა ფრონტალური ფოტოგრაფიით Nikon მიკროსკოპის (SMZ1500) გამოყენებით DigiLite კამერით და TCapture პროგრამული უზრუნველყოფით (Tucsen Photonics, ჩინეთი).სურათები მიღებულ იქნა 20x გადიდებით (მათ შორის ტრაქეის სრული სიგანის მაქსიმალური პარამეტრით), ტრაქეის მთელი სიგრძე ნაჩვენებია ეტაპობრივად, რაც უზრუნველყოფს საკმარის გადახურვას თითოეულ სურათს შორის, რათა შესაძლებელი იყოს სურათების "დაკერვა".შემდეგ თითოეული ტრაქეიდან გამოსახულებები გაერთიანდა ერთ კომპოზიტურ სურათში Composite Image Editor ვერსიის 2.0.3 (Microsoft Research) გამოყენებით პლანარული მოძრაობის ალგორითმის გამოყენებით. LacZ გამოხატვის არეალი ტრაქეის კომპოზიციურ სურათებში თითოეული ცხოველიდან რაოდენობრივად შეფასდა ავტომატური MATLAB სკრიპტის (R2020a, MathWorks) გამოყენებით, როგორც ადრე იყო აღწერილი28, 0.35 <Hue <0.58, Saturation > 0.15 და Value <0.7 პარამეტრების გამოყენებით. LacZ-ის გამოხატვის არე ტრაქეის კომპოზიციურ სურათებში თითოეული ცხოველიდან რაოდენობრივად შეფასდა ავტომატური MATLAB სკრიპტის გამოყენებით (R2020a, MathWorks), როგორც ადრე იყო აღწერილი28, 0.35 <Hue <0.58, Saturation > 0.15 და Value <0.7 პარამეტრების გამოყენებით. Ploщадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была кольчественно определено со использованием автоматизированного სცენა MATLAB (R2020a, MathWorks), როგორც оценет на <5,28, насыщенность> 0,15 и მნიშვნელობა <0 , 7. LacZ-ის გამოხატვის ფართობი თითოეული ცხოველის ტრაქეის კომპოზიტურ სურათებში რაოდენობრივად შეფასდა ავტომატური MATLAB სკრიპტის გამოყენებით (R2020a, MathWorks), როგორც ადრე იყო აღწერილი28 0.35 პარამეტრების გამოყენებით.0,15 და მნიშვნელობა<0 ,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复本（R2020a，对来自每只动物的气管复合合进行量化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， მათემატიკის მუშაობა） 来自 每 只 的 气管 复表达 量化 ， 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。 ............ ჰიპი Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи како жительного количественно определяли со использованием автоматизированного სცენა MATLAB (R2020a, MathWorks), како описано ранее, со искористување <5,000 0,15 და მნიშვნელობა <0,7 . თითოეული ცხოველის ტრაქეის კომპოზიციურ გამოსახულებებზე LacZ-ის გამოხატვის არეები რაოდენობრივად იქნა შეფასებული ავტომატური MATLAB სკრიპტის გამოყენებით (R2020a, MathWorks), როგორც ადრე იყო აღწერილი 0,35 < ელფერი < 0,58, გაჯერება > 0,15 და მნიშვნელობა < 0,7 .GIMP v2.10.24-ში ქსოვილის კონტურების თვალყურის დევნებით, ხელით შეიქმნა ნიღაბი თითოეული კომპოზიტური სურათისთვის, რათა იდენტიფიცირდეს ქსოვილის არე და თავიდან აიცილოს ნებისმიერი ცრუ გამოვლენა ტრაქეის ქსოვილის გარეთ.შეღებილი ადგილები თითოეული ცხოველის ყველა კომპოზიციური სურათიდან შეჯამდა, რათა მიეცეს ამ ცხოველის მთლიანი შეღებილი ფართობი.შემდეგ მოხატული ტერიტორია გაიყო ნიღბის მთლიან ფართობზე, რათა მიიღოთ ნორმალიზებული ფართობი.
თითოეული ტრაქეა ჩაშენებული იყო პარაფინში და დაყოფილი იყო 5 მკმ სისქით.სექციები შეღებილი იქნა ნეიტრალური სწრაფი წითელით 5 წუთის განმავლობაში და სურათები იქნა მიღებული Nikon Eclipse E400 მიკროსკოპის, DS-Fi3 კამერისა და NIS ელემენტების გადაღების პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით (ვერსია 5.20.00).
ყველა სტატისტიკური ანალიზი ჩატარდა GraphPad Prism v9-ში (GraphPad Software, Inc.).სტატისტიკური მნიშვნელობა დაყენდა p ≤ 0.05.ნორმალურობა შემოწმდა Shapiro-Wilk ტესტის გამოყენებით და განსხვავებები LacZ შეღებვაში შეფასდა დაუწყვილებელი t-ტესტის გამოყენებით.
ცხრილი 1-ში აღწერილი ექვსი MP შესწავლილი იქნა PCXI-ით და ხილვადობა აღწერილია ცხრილში 2. ორი პოლისტიროლის MPs (MP1 და MP2; 18 μm და 0.25 μm, შესაბამისად) არ იყო ხილული PCXI-ით, მაგრამ დარჩენილი ნიმუშების იდენტიფიცირება შესაძლებელი იყო. (მაგალითები ნაჩვენებია სურათზე 5).MP3 და MP4 სუსტად ჩანს (10-15% Fe3O4; 0.25 μm და 0.9 μm, შესაბამისად).მიუხედავად იმისა, რომ MP5 (98% Fe3O4; 0,25 მკმ) შეიცავდა ტესტირებულ უმცირეს ნაწილაკებს, ის ყველაზე გამოხატული იყო.CombiMag MP6 პროდუქტის გარჩევა რთულია.ყველა შემთხვევაში, MF-ების აღმოჩენის ჩვენი უნარი მნიშვნელოვნად გაუმჯობესდა მაგნიტის კაპილარების პარალელურად წინ და უკან გადაადგილებით.როდესაც მაგნიტები შორდებიან კაპილარს, ნაწილაკები გრძელ ჯაჭვებში გამოიყვანდნენ, მაგრამ როდესაც მაგნიტები მიუახლოვდნენ და მაგნიტური ველის სიძლიერე გაიზარდა, ნაწილაკების ჯაჭვები შემცირდა, როდესაც ნაწილაკები მიგრირებდნენ კაპილარის ზედა ზედაპირისკენ (იხილეთ დამატებითი ვიდეო S1 : MP4), იზრდება ნაწილაკების სიმკვრივე ზედაპირზე.პირიქით, როდესაც მაგნიტი ამოღებულია კაპილარიდან, ველის სიძლიერე მცირდება და დეპუტატები გადანაწილდებიან გრძელ ჯაჭვებად, რომლებიც ვრცელდება კაპილარის ზედა ზედაპირიდან (იხ. დამატებითი ვიდეო S2: MP4).მას შემდეგ, რაც მაგნიტი შეწყვეტს მოძრაობას, ნაწილაკები აგრძელებენ მოძრაობას წონასწორობის პოზიციის მიღწევის შემდეგ გარკვეული დროის განმავლობაში.როგორც MP მოძრაობს კაპილარების ზედა ზედაპირისკენ და შორს, მაგნიტური ნაწილაკები მიდრეკილნი არიან ნამსხვრევების მიზიდვაში სითხეში.
MP-ის ხილვადობა PCXI-ში მნიშვნელოვნად განსხვავდება ნიმუშებს შორის.(ა) MP3, (ბ) MP4, (გ) MP5 და (დ) MP6.აქ ნაჩვენები ყველა სურათი გადაღებულია მაგნიტით, რომელიც მდებარეობს დაახლოებით 10 მმ-ზე პირდაპირ კაპილარზე.აშკარად დიდი წრეები არის ჰაერის ბუშტები ჩაფლული კაპილარებში, რაც ნათლად აჩვენებს ფაზის კონტრასტის გამოსახულების შავი და თეთრი კიდეების მახასიათებლებს.წითელი ყუთი მიუთითებს გადიდებას, რომელიც აძლიერებს კონტრასტს.გაითვალისწინეთ, რომ ყველა ფიგურაში მაგნიტური წრეების დიამეტრი არ არის მასშტაბური და დაახლოებით 100-ჯერ მეტია, ვიდრე ნაჩვენებია.
როდესაც მაგნიტი მოძრაობს მარცხნივ და მარჯვნივ კაპილარების ზევით, MP სიმის კუთხე იცვლება მაგნიტის შესასწორებლად (იხ. სურათი 6), რითაც გამოიყოფა მაგნიტური ველის ხაზები.MP3-5-ისთვის, მას შემდეგ, რაც აკორდი მიაღწევს ზღურბლ კუთხეს, ნაწილაკები გადაჭიმულია კაპილარის ზედა ზედაპირის გასწვრივ.ეს ხშირად იწვევს დეპუტატების დაჯგუფებას უფრო დიდ ჯგუფებად იქ, სადაც მაგნიტური ველი ყველაზე ძლიერია (იხ. დამატებითი ვიდეო S3: MP5).ეს ასევე განსაკუთრებით ვლინდება კაპილარების ბოლოსთან ახლოს გამოსახულების გადაღებისას, რაც იწვევს MP-ის აგრეგაციას და კონცენტრირებას თხევადი ჰაერის ინტერფეისზე.MP6-ში ნაწილაკები, რომელთა გარჩევა უფრო რთული იყო, ვიდრე MP3-5-ში, არ ათრევდნენ, როდესაც მაგნიტი მოძრაობდა კაპილარების გასწვრივ, მაგრამ MP სიმები დაშორდა, რის შედეგადაც ნაწილაკები ჩანდა (იხილეთ დამატებითი ვიდეო S4: MP6).ზოგიერთ შემთხვევაში, როდესაც გამოყენებული მაგნიტური ველი მცირდებოდა მაგნიტის გამოსახულების ადგილიდან დიდ მანძილზე გადაადგილებით, ნებისმიერი დარჩენილი დეპუტატი ნელა ეშვებოდა მილის ქვედა ზედაპირზე გრავიტაციით და რჩებოდა სტრიქონში (იხ. დამატებითი ვიდეო S5: MP3). .
MP სიმის კუთხე იცვლება, როდესაც მაგნიტი მოძრაობს მარჯვნივ კაპილარების ზემოთ.(ა) MP3, (ბ) MP4, (გ) MP5 და (დ) MP6.წითელი ყუთი მიუთითებს გადიდებას, რომელიც აძლიერებს კონტრასტს.გთხოვთ, გაითვალისწინოთ, რომ დამატებითი ვიდეოები საინფორმაციო მიზნებისთვისაა, რადგან ისინი ავლენენ მნიშვნელოვან ნაწილაკების სტრუქტურას და დინამიურ ინფორმაციას, რომლის ვიზუალიზაცია შეუძლებელია ამ სტატიკურ სურათებში.
ჩვენმა ტესტებმა აჩვენა, რომ მაგნიტის წინ და უკან ნელა მოძრაობა ტრაქეის გასწვრივ ხელს უწყობს MF-ის ვიზუალიზაციას რთული მოძრაობის კონტექსტში in vivo.არ ჩატარებულა in vivo ტესტები, რადგან პოლისტიროლის მარცვლები (MP1 და MP2) არ ჩანდა კაპილარში.დარჩენილი ოთხი MF-დან თითოეული ტესტირება ჩატარდა in vivo მაგნიტის გრძელი ღერძით, რომელიც განლაგებულია ტრაქეაზე დაახლოებით 30°-იანი კუთხით ვერტიკალურთან (იხ. ნახატები 2b და 3a), რადგან ამან გამოიწვია უფრო გრძელი MF ჯაჭვები და უფრო ეფექტური იყო. ვიდრე მაგნიტი..კონფიგურაცია შეწყდა.MP3, MP4 და MP6 არ არის ნაპოვნი ცოცხალი ცხოველის ტრაქეაში.ცხოველების ჰუმანურად მოკვლის შემდეგ ვირთხების სასუნთქი გზების ვიზუალიზაციისას ნაწილაკები უხილავი რჩებოდა მაშინაც კი, როდესაც დამატებით მოცულობას ამატებდნენ შპრიცის ტუმბოს გამოყენებით.MP5-ს ჰქონდა რკინის ოქსიდის ყველაზე მაღალი შემცველობა და იყო ერთადერთი ხილული ნაწილაკი, ამიტომ გამოიყენებოდა MP ქცევის შესაფასებლად და დასახასიათებლად in vivo.
მაგნიტის განთავსებამ ტრაქეაზე MF-ის ჩასმისას გამოიწვია მრავალი, მაგრამ არა ყველა, MF-ის კონცენტრირება ხედვის ველში.ნაწილაკების ტრაქეაში შესვლა საუკეთესოდ შეინიშნება ჰუმანურად ევთანიზირებულ ცხოველებში.სურათი 7 და დამატებითი ვიდეო S6: MP5 გვიჩვენებს ნაწილაკების სწრაფ მაგნიტურ დაჭერას და განლაგებას ვენტრალური ტრაქეის ზედაპირზე, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ MPs შეიძლება მიზანმიმართული იყოს ტრაქეის სასურველ უბნებზე.MF-ის მიწოდების შემდეგ ტრაქეის გასწვრივ უფრო დისტალურად ძიებისას, ზოგიერთი MF აღმოჩნდა კარინასთან უფრო ახლოს, რაც მიუთითებს არასაკმარისი მაგნიტური ველის სიძლიერეზე ყველა MF-ის შესაგროვებლად და შესანარჩუნებლად, რადგან ისინი მიეწოდება მაქსიმალური მაგნიტური ველის სიძლიერის რეგიონში სითხის შეყვანისას.პროცესი.თუმცა, პოსტნატალური MP კონცენტრაციები უფრო მაღალი იყო გამოსახულების არეალის გარშემო, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ბევრი დეპუტატი დარჩა სასუნთქი გზების რეგიონებში, სადაც გამოყენებული მაგნიტური ველის სიძლიერე იყო ყველაზე მაღალი.
სურათები (ა) MP5-ის მიწოდების წინ და (ბ) ბოლო ევთანასირებული ვირთხის ტრაქეაში მიტანის შემდეგ, მაგნიტით, რომელიც განთავსებულია გამოსახულების ზონის ზემოთ.გამოსახული უბანი მდებარეობს ორ ხრტილოვან რგოლს შორის.სასუნთქ გზებში არის გარკვეული სითხე დეპუტატის გაჩენამდე.წითელი ყუთი მიუთითებს გადიდებას, რომელიც აძლიერებს კონტრასტს.ეს სურათები აღებულია S6-ში წარმოდგენილი ვიდეოდან: MP5 დამატებითი ვიდეო.
მაგნიტის გადაადგილება ტრაქეის გასწვრივ in vivo გამოიწვია MP ჯაჭვის კუთხის ცვლილება სასუნთქი გზების ზედაპირზე, მსგავსი კაპილარებში (იხ. სურათი 8 და დამატებითი ვიდეო S7: MP5).თუმცა, ჩვენს კვლევაში დეპუტატების გადათრევა არ შეიძლებოდა ცოცხალი სასუნთქი გზების ზედაპირზე, როგორც ეს კაპილარებს შეეძლოთ.ზოგიერთ შემთხვევაში, MP ჯაჭვი გრძელდება, როდესაც მაგნიტი მოძრაობს მარცხნივ და მარჯვნივ.საინტერესოა, რომ ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ, რომ ნაწილაკების ჯაჭვი ცვლის სითხის ზედაპირული ფენის სიღრმეს, როდესაც მაგნიტი გრძივად მოძრაობს ტრაქეის გასწვრივ და ფართოვდება, როდესაც მაგნიტი გადაადგილდება პირდაპირ თავზე და ნაწილაკების ჯაჭვი ბრუნავს ვერტიკალურ მდგომარეობაში (იხ. დამატებითი ვიდეო S7).: MP5 0:09-ზე, ქვედა მარჯვნივ).მოძრაობის დამახასიათებელი ნიმუში შეიცვალა, როდესაც მაგნიტი გადაადგილდებოდა ლატერალურად ტრაქეის თავზე (ანუ ცხოველის მარცხნივ ან მარჯვნივ, ვიდრე ტრაქეის სიგრძის გასწვრივ).ნაწილაკები ჯერ კიდევ აშკარად ჩანდა მათი მოძრაობის დროს, მაგრამ როდესაც მაგნიტი ამოიღეს ტრაქეიდან, ნაწილაკების სტრიქონების წვერები ხილული გახდა (იხილეთ დამატებითი ვიდეო S8: MP5, დაწყებული 0:08-ზე).ეს ეთანხმება მაგნიტური ველის დაკვირვებულ ქცევას მინის კაპილარში გამოყენებული მაგნიტური ველის მოქმედებით.
სურათების ნიმუშები, სადაც ნაჩვენებია MP5 ცოცხალი ანესთეზირებული ვირთხის ტრაქეაში.(ა) მაგნიტი გამოიყენება გამოსახულების მისაღებად ტრაქეის ზემოთ და მარცხნივ, შემდეგ (ბ) მაგნიტის მარჯვნივ გადაადგილების შემდეგ.წითელი ყუთი მიუთითებს გადიდებას, რომელიც აძლიერებს კონტრასტს.ეს სურათები არის ვიდეოდან, რომელიც წარმოდგენილია S7-ის დამატებით ვიდეოში: MP5.
როდესაც ორი პოლუსი იყო მორგებული ჩრდილოეთ-სამხრეთის ორიენტაციაზე ტრაქეის ზემოთ და ქვემოთ (ანუ მიზიდულობა; სურ. 3b), MP აკორდები უფრო გრძელი ჩანდა და განლაგებული იყო ტრაქეის გვერდით კედელზე და არა ზურგის ზედაპირზე. ტრაქეა (იხ. დანართი).ვიდეო S9: MP5).თუმცა, ნაწილაკების მაღალი კონცენტრაცია ერთ ადგილზე (ანუ ტრაქეის დორსალური ზედაპირი) არ იქნა გამოვლენილი სითხის შეყვანის შემდეგ ორმაგი მაგნიტის მოწყობილობის გამოყენებით, რაც ჩვეულებრივ ხდება ერთი მაგნიტის მოწყობილობით.შემდეგ, როდესაც ერთი მაგნიტი იყო კონფიგურირებული საპირისპირო პოლუსების მოსაგერიებლად (სურათი 3c), მხედველობის ველში ხილული ნაწილაკების რაოდენობა არ გაიზარდა მიწოდების შემდეგ.ორივე ორი მაგნიტის კონფიგურაციის დაყენება რთულია მაგნიტური ველის მაღალი სიძლიერის გამო, რომელიც იზიდავს ან უბიძგებს მაგნიტებს შესაბამისად.შემდეგ კონფიგურაცია შეიცვალა ერთი მაგნიტით სასუნთქი გზების პარალელურად, მაგრამ გადის სასუნთქ გზებში 90 გრადუსიანი კუთხით ისე, რომ ძალის ხაზები გადაკვეთა ტრაქეის კედელს ორთოგონალურად (სურათი 3d), ორიენტაცია, რომელიც განკუთვნილია ნაწილაკების აგრეგაციის შესაძლებლობის დასადგენად. გვერდითი კედელი.დაკვირვებული იყოს.თუმცა, ამ კონფიგურაციაში, არ იყო იდენტიფიცირებადი MF დაგროვების მოძრაობა ან მაგნიტის მოძრაობა.ყველა ამ შედეგის საფუძველზე, არჩეული იქნა კონფიგურაცია ერთი მაგნიტით და 30 გრადუსიანი ორიენტირებით გენის მატარებლების in vivo კვლევებისთვის (ნახ. 3a).
როდესაც ცხოველს ჰუმანურად მსხვერპლად შეწირვისთანავე რამდენჯერმე გადაუღეს გამოსახულება, ქსოვილის შემაფერხებელი მოძრაობის არარსებობა ნიშნავდა, რომ უფრო თხელი, მოკლე ნაწილაკების ხაზები შეინიშნებოდა მკაფიო ხრტილთაშორის ველში, „რხევა“ მაგნიტის მთარგმნელობითი მოძრაობის შესაბამისად.ნათლად ვხედავ MP6 ნაწილაკების არსებობას და მოძრაობას.
LV-LacZ-ის ტიტრი იყო 1.8 x 108 სე/მლ და CombiMag MP-თან (MP6) 1:1 შერევის შემდეგ ცხოველებს გაუკეთეს 50 μl ტრაქეალური დოზა 9 x 107 სე/მლ LV სატრანსპორტო საშუალების (ანუ 4.5). x 106 TU/ვირთხა).)).ამ კვლევებში, მშობიარობის დროს მაგნიტის გადაადგილების ნაცვლად, ჩვენ დავაფიქსირეთ მაგნიტი ერთ პოზიციაში, რათა განვსაზღვროთ, შეიძლებოდა თუ არა LV ტრანსდუქცია (a) გაუმჯობესებულიყო ვექტორთან შედარებით მაგნიტური ველის არარსებობის შემთხვევაში და (b) თუ სასუნთქი გზები შეიძლებოდა. იყოს ორიენტირებული.უჯრედების ტრანსდუქცია ხდება ზედა სასუნთქი გზების მაგნიტურ სამიზნე უბნებში.
მაგნიტების არსებობა და CombiMag-ის გამოყენება LV ვექტორებთან ერთად, როგორც ჩანს, უარყოფითად არ იმოქმედებს ცხოველთა ჯანმრთელობაზე, ისევე როგორც ჩვენი სტანდარტული LV ვექტორის მიწოდების პროტოკოლი.ტრაქეალური რეგიონის ფრონტალურმა სურათებმა, რომელიც ექვემდებარება მექანიკურ აშლილობას (დამატებითი სურ. 1) აჩვენა, რომ LV-MP დამუშავებულ ჯგუფს ჰქონდა ტრანსდუქციის მნიშვნელოვნად მაღალი დონე მაგნიტის თანდასწრებით (ნახ. 9a).მხოლოდ მცირე რაოდენობით ლურჯი LacZ შეღებვა იყო საკონტროლო ჯგუფში (სურათი 9b).X-Gal-ით შეღებილი ნორმალიზებული რეგიონების რაოდენობრივმა განსაზღვრამ აჩვენა, რომ LV-MP-ის შეყვანა მაგნიტური ველის თანდასწრებით იწვევს დაახლოებით 6-ჯერ გაუმჯობესებას (ნახ. 9c).
კომპოზიციური სურათების მაგალითი, რომელიც აჩვენებს ტრაქეის ტრანსდუქციას LV-MP-ით (a) მაგნიტური ველის არსებობისას და (ბ) მაგნიტის არარსებობის შემთხვევაში.(გ) სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი გაუმჯობესება ტრაქეაში LacZ-ის ტრანსდუქციის ნორმალიზებულ არეალში მაგნიტის გამოყენებით (*p = 0.029, t-ტესტი, n = 3 ჯგუფში, საშუალო ± საშუალო სტანდარტული შეცდომა).
ნეიტრალური სწრაფად წითელი შეღებილი სექციები (მაგალითი ნაჩვენებია დამატებით ნახ. 2-ში) მიუთითებს, რომ LacZ-ით შეღებილი უჯრედები იმყოფებოდა იმავე ნიმუშში და იმავე ადგილას, როგორც ადრე იყო მოხსენებული.
სასუნთქი გზების გენური თერაპიის მთავარი გამოწვევა რჩება მატარებელი ნაწილაკების ზუსტი ლოკალიზაცია ინტერესის სფეროებში და მაღალი დონის ტრანსდუქციის ეფექტურობის მიღწევა მობილურ ფილტვში ჰაერის ნაკადის და აქტიური ლორწოს კლირენსის არსებობისას.LV მატარებლებისთვის, რომლებიც განკუთვნილია კისტოზური ფიბროზის დროს რესპირატორული დაავადებების სამკურნალოდ, გამტარ სასუნთქ გზებში გადამზიდავი ნაწილაკების ბინადრობის დროის გაზრდა აქამდე მიუღწეველი მიზანი იყო.როგორც Castellani et al.-მა აღნიშნა, მაგნიტური ველების გამოყენებას ტრანსდუქციის გასაძლიერებლად აქვს უპირატესობა სხვა გენის მიწოდების მეთოდებთან შედარებით, როგორიცაა ელექტროპორაცია, რადგან მას შეუძლია დააკავშიროს სიმარტივე, ეკონომიურობა, ლოკალიზებული მიწოდება, გაზრდილი ეფექტურობა და ინკუბაციის ხანმოკლე დრო.და შესაძლოა ავტომობილის უფრო დაბალი დოზა10.თუმცა, in vivo დეპონირება და მაგნიტური ნაწილაკების ქცევა სასუნთქ გზებში გარე მაგნიტური ძალების გავლენის ქვეშ არასოდეს ყოფილა აღწერილი და ფაქტიურად ამ მეთოდის უნარი გაზარდოს გენის ექსპრესიის დონე ხელუხლებელ ცოცხალ სასუნთქ გზებში არ არის ნაჩვენები in vivo.
ჩვენმა ინ ვიტრო ექსპერიმენტებმა PCXI სინქროტრონზე აჩვენა, რომ ჩვენ მიერ გამოკვლეული ყველა ნაწილაკი, გარდა MP პოლისტიროლისა, ხილული იყო ჩვენ მიერ გამოყენებული გამოსახულების პარამეტრებში.მაგნიტური ველის არსებობისას მაგნიტური ველები ქმნიან სიმებს, რომელთა სიგრძე დაკავშირებულია ნაწილაკების ტიპთან და მაგნიტური ველის სიძლიერესთან (ანუ მაგნიტის სიახლოვესა და მოძრაობასთან).როგორც ნახაზი 10-ზეა ნაჩვენები, სიმები, რომელსაც ჩვენ ვაკვირდებით, იქმნება, როდესაც თითოეული ცალკეული ნაწილაკი მაგნიტირდება და იწვევს საკუთარ ადგილობრივ მაგნიტურ ველს.ეს ცალკეული ველები იწვევენ სხვა მსგავსი ნაწილაკების შეგროვებას და დაკავშირებას ჯგუფურ სიმებიანი მოძრაობებით, ადგილობრივი ძალების გამო, ადგილობრივი მიზიდულობისა და სხვა ნაწილაკების მოგერიების ძალებისგან.
დიაგრამა აჩვენებს (a, b) ნაწილაკების ჯაჭვებს, რომლებიც წარმოიქმნება სითხით სავსე კაპილარებში და (c, d) ჰაერით სავსე ტრაქეაში.გაითვალისწინეთ, რომ კაპილარები და ტრაქეა არ არის დახატული მასშტაბით.პანელი (a) ასევე შეიცავს MF-ის აღწერას, რომელიც შეიცავს ჯაჭვებში განლაგებულ Fe3O4 ნაწილაკებს.
როდესაც მაგნიტი გადავიდა კაპილარზე, ნაწილაკების სიმის კუთხემ მიაღწია კრიტიკულ ზღურბლს MP3-5-ისთვის, რომელიც შეიცავს Fe3O4-ს, რის შემდეგაც ნაწილაკების სტრიქონი აღარ დარჩა თავდაპირველ მდგომარეობაში, არამედ გადავიდა ზედაპირის გასწვრივ ახალ პოზიციაზე.მაგნიტი.ეს ეფექტი, სავარაუდოდ, იმის გამო ხდება, რომ შუშის კაპილარების ზედაპირი საკმარისად გლუვია, რომ ეს მოძრაობა მოხდეს.საინტერესოა, რომ MP6 (CombiMag) ასე არ მოიქცა, ალბათ იმიტომ, რომ ნაწილაკები იყო უფრო პატარა, ჰქონდათ განსხვავებული საფარი ან ზედაპირული მუხტი, ან საკუთრების გადამზიდავი სითხე გავლენას ახდენდა მათ გადაადგილების უნარზე.CombiMag ნაწილაკების სურათში კონტრასტი ასევე სუსტია, რაც იმაზე მეტყველებს, რომ სითხესა და ნაწილაკებს შეიძლება ჰქონდეთ ერთი და იგივე სიმკვრივე და, შესაბამისად, ადვილად ვერ გადაადგილდებიან ერთმანეთისკენ.ნაწილაკები ასევე შეიძლება გაიჭედოს, თუ მაგნიტი ძალიან სწრაფად მოძრაობს, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ მაგნიტური ველის სიძლიერე ყოველთვის ვერ ახერხებს სითხეში ნაწილაკებს შორის ხახუნის გადალახვას, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ მაგნიტური ველის სიძლიერე და მანძილი მაგნიტსა და სამიზნეს შორის არ უნდა იყოს გაოცება.მნიშვნელოვანი.ეს შედეგები ასევე მიუთითებს იმაზე, რომ მიუხედავად იმისა, რომ მაგნიტებს შეუძლიათ დაიჭირონ მრავალი მიკრონაწილაკი, რომელიც მიედინება სამიზნე ზონაში, ნაკლებად სავარაუდოა, რომ მაგნიტებს დაეყრდნოთ CombiMag ნაწილაკების გადაადგილებისთვის ტრაქეის ზედაპირის გასწვრივ.ამრიგად, ჩვენ დავასკვენით, რომ in vivo LV MF კვლევებმა უნდა გამოიყენოს სტატიკური მაგნიტური ველები სასუნთქი გზების ხის კონკრეტული უბნების ფიზიკურად დასამიზნებლად.
ნაწილაკების სხეულში მიტანის შემდეგ, მათი იდენტიფიცირება რთულია სხეულის რთული მოძრავი ქსოვილის კონტექსტში, მაგრამ მათი გამოვლენის უნარი გაუმჯობესდა მაგნიტის ჰორიზონტალურად გადაადგილებით ტრაქეაზე, რათა „გააძვრინა“ MP სიმები.მიუხედავად იმისა, რომ რეალურ დროში გამოსახულება შესაძლებელია, უფრო ადვილია ნაწილაკების მოძრაობის გარჩევა ცხოველის ჰუმანურად მოკვლის შემდეგ.MP კონცენტრაცია ჩვეულებრივ ყველაზე მაღალი იყო ამ ადგილას, როდესაც მაგნიტი იყო განლაგებული გამოსახულების ზონაზე, თუმცა ზოგიერთი ნაწილაკი ჩვეულებრივ ტრაქეის ქვემოთ იყო ნაპოვნი.ინ ვიტრო კვლევებისაგან განსხვავებით, ნაწილაკები არ შეიძლება ტრაქეაში ჩაითრევა მაგნიტის მოძრაობით.ეს დასკვნა შეესაბამება იმას, თუ როგორ ამუშავებს ლორწოს, რომელიც ფარავს ტრაქეის ზედაპირს, ჩასუნთქულ ნაწილაკებს, აკავებს მათ ლორწოს და შემდგომ ასუფთავებს მათ ლორწოვან-ცილიარული კლირენსის მექანიზმით.
ჩვენ ვივარაუდეთ, რომ მიზიდულობისთვის ტრაქეის ზემოთ და ქვემოთ მაგნიტების გამოყენებამ (ნახ. 3b) შეიძლება გამოიწვიოს უფრო ერთგვაროვანი მაგნიტური ველი, ვიდრე მაგნიტური ველი, რომელიც ძალიან კონცენტრირებულია ერთ წერტილში, რაც პოტენციურად გამოიწვევს ნაწილაკების უფრო ერთგვაროვან განაწილებას..თუმცა, ჩვენმა წინასწარმა კვლევამ ვერ იპოვა მკაფიო მტკიცებულება ამ ჰიპოთეზის გასამყარებლად.ანალოგიურად, მაგნიტების წყვილის მოსაგერიებლად დაყენება (ნახ. 3c) არ მოჰყოლია მეტი ნაწილაკების დასახლებას გამოსახულების არეში.ეს ორი აღმოჩენა ცხადყოფს, რომ ორმაგი მაგნიტის დაყენება მნიშვნელოვნად არ აუმჯობესებს MP-ის მითითების ლოკალურ კონტროლს და რომ შედეგად მიღებული ძლიერი მაგნიტური ძალები ძნელია მორგება, რაც ამ მიდგომას ნაკლებად პრაქტიკულს ხდის.ანალოგიურად, ტრაქეის ზემოთ და ტრაქეის გასწვრივ მაგნიტის ორიენტირება (სურათი 3d) ასევე არ გაზრდის გამოსახულების ზონაში დარჩენილი ნაწილაკების რაოდენობას.ზოგიერთი ალტერნატიული კონფიგურაცია შეიძლება არ იყოს წარმატებული, რადგან ისინი იწვევს მაგნიტური ველის სიძლიერის შემცირებას დეპონირების ზონაში.ამრიგად, ერთი მაგნიტის კონფიგურაცია 30 გრადუსზე (ნახ. 3a) ითვლება უმარტივეს და ყველაზე ეფექტურ in vivo ტესტირების მეთოდად.
LV-MP კვლევამ აჩვენა, რომ როდესაც LV ვექტორები კომბინირებული იყო CombiMag-თან და მიწოდებული იქნა ფიზიკურად აშლილობის შემდეგ მაგნიტური ველის თანდასწრებით, ტრანსდუქციის დონე საგრძნობლად გაიზარდა ტრაქეაში კონტროლებთან შედარებით.სინქროტრონის გამოსახულების კვლევებზე და LacZ-ის შედეგებზე დაყრდნობით, როგორც ჩანს, მაგნიტურ ველს შეეძლო LV-ის შენარჩუნება ტრაქეაში და ამცირებს ვექტორული ნაწილაკების რაოდენობას, რომლებიც მაშინვე ღრმად შეაღწიეს ფილტვებში.დამიზნების ასეთმა გაუმჯობესებამ შეიძლება გამოიწვიოს უფრო მაღალი ეფექტურობა მიწოდებული ტიტრის, არამიზნობრივი ტრანსდუქციის, ანთებითი და იმუნური გვერდითი ეფექტების და გენის გადაცემის ხარჯების შემცირებისას.მნიშვნელოვანია, რომ მწარმოებლის თქმით, CombiMag შეიძლება გამოყენებულ იქნას გენის გადაცემის სხვა მეთოდებთან, მათ შორის სხვა ვირუსულ ვექტორებთან (როგორიცაა AAV) და ნუკლეინის მჟავებთან ერთად.