Giardia თორმეტგოჯა ნაწლავი არის პარაზიტული ორგანიზმი, რომელიც იწვევს გიარდიაზს, ნაწლავურ ინფექციას, განსაკუთრებით ხშირია მცირეწლოვან ბავშვებში დიარეის კლინიკური ნიშნებით.ჩვენ ადრე ავღნიშნეთ, რომ უჯრედგარე G. duodenalis იწვევს უჯრედშიდა ოლიგომერიზაციის მსგავსი რეცეპტორების 3 (NLRP3) დამაკავშირებელი ნუკლეოტიდების აქტივაციას და არეგულირებს მასპინძლის ანთებით პასუხებს უჯრედგარე ვეზიკულური სეკრეციის (EV) სეკრეციის მეშვეობით.თუმცა, ამ პროცესში ჩართული პათოგენთან ასოცირებული თორმეტგოჯა ნაწლავის EV (GEV) ზუსტი მოლეკულური ნიმუშები და NLRP3 ანთებითი პროცესების როლი გიარდიაზში რჩება გასარკვევი.
რეკომბინანტული ევკარიოტული ექსპრესიის პლაზმიდები pcDNA3.1(+)-ალფა-2 და ალფა-7.3 გიარდინები GEV-ში აშენდა, ტრანსფექტირდა თაგვის პირველად პერიტონეალურ მაკროფაგებში და გამოვლინდა ანთების სამიზნე მოლეკულის კასპაზა-1-ის გაზომვით.სკრინინგდა p20 გამოხატვის დონე..G. duodenalis alpha-2 და alpha-7.3 giardines თავდაპირველად იდენტიფიცირებული იყო NLRP3 ანთების (NLRP3, პრო-ინტერლეუკინ-1 ბეტა [IL-1β], პრო-კასპაზა-1 და კასპაზა-1 p20), IL სეკრეციის გაზომვით.1β დონეები, აპოპტოზური ლაქოვანი ცილის (ASC) ოლიგომერიზაციის დონეები და NLRP3 და ASC-ის იმუნოფლუორესცენტული ლოკალიზაცია.NLRP3 ანთებითი პროცესის როლი G. duodenalis-ის პათოგენურობაში შეფასდა თაგვების გამოყენებით, რომლებშიც დაბლოკილი იყო NLRP3 აქტივაცია (NLRP3 დაბლოკილი თაგვები) და მონიტორინგებული იყო სხეულის წონის პათოლოგიური ცვლილებები, თორმეტგოჯა ნაწლავის პარაზიტული დატვირთვა და თორმეტგოჯა ნაწლავის ქსოვილი.გარდა ამისა, ჩვენ გამოვიკვლიეთ, იწვევენ თუ არა ჰიარდინები ალფა-2 და ალფა-7.3 IL-1β სეკრეციას in vivo NLRP3 ანთებითი პროცესების მეშვეობით და დავადგინეთ ამ მოლეკულების როლი G. duodenalis-ის პათოგენურობაში თაგვებში.
ალფა-2 და ალფა-7.3 გიარდინები იწვევენ NLRP3 ანთებითი პროცესების გააქტიურებას in vitro.ამან გამოიწვია p20 კასპაზა-1-ის გააქტიურება, NLRP3, პრო-IL-1β და პრო-კასპაზა-1 ცილების ექსპრესიის დონის მატება, IL-1β სეკრეციის მნიშვნელოვანი მატება, ASA ლაქების წარმოქმნა. ციტოპლაზმა და ASA ოლიგომერიზაციის ინდუქცია.NLRP3 ანთება პენისის დაკარგვა აძლიერებს G. duodenalis-ის პათოგენურობას თაგვებში.თაგვები, რომლებსაც მკურნალობდნენ ცისტებით NLRP3 ბლოკირებული თაგვებიდან, აღენიშნებოდათ ტროფოზოიტების გაზრდილი რაოდენობა და თორმეტგოჯა ნაწლავის ჯირკვლის მძიმე დაზიანება, რაც ხასიათდება ნეკროზული კრიპტებით შეკუმშვით და განშტოებით.in vivo ექსპერიმენტებმა აჩვენა, რომ ჯიარდინებს ალფა-2 და ალფა-7.3 შეუძლიათ გამოიწვიონ IL-1β სეკრეცია NLRP3 ანთებითი პროცესების მეშვეობით, ხოლო იმუნიზაცია გიარდინებით ალფა-2 და ალფა-7.3 ამცირებს G. duodenalis-ის პათოგენურობას თაგვებში.
ერთად აღებული, ამ კვლევის შედეგები ვარაუდობს, რომ ჯიარდია ალფა-2 და ალფა-7.3 იწვევენ მასპინძლის NLRP3 ანთების რეგულაციას და ამცირებენ G. duodenalis-ის ინფექციურობას თაგვებში, რომლებიც პერსპექტიული სამიზნეებია გიარდიოზის პროფილაქტიკისთვის.
Giardia duodenum არის უჯრედგარე პროტოზოული პარაზიტი, რომელიც ცხოვრობს წვრილ ნაწლავში და ყოველწლიურად იწვევს 280 მილიონ შემთხვევას დიარეით, განსაკუთრებით განვითარებად ქვეყნებში მცირეწლოვან ბავშვებში [1].ადამიანები ინფიცირდებიან სასმელი წყლით ან საკვებით დაბინძურებული M. თორმეტგოჯა ნაწლავის ცისტებით, რომლებიც შემდეგ შედიან კუჭში და გამოიყოფა კუჭის წვენებში.Giardia თორმეტგოჯა ნაწლავის ტროფოზოიტები მიმაგრებულია თორმეტგოჯა ნაწლავის ეპითელიუმზე, რაც იწვევს გულისრევას, ღებინებას, დიარეას, მუცლის ტკივილს და წონის დაკლებას.იმუნოდეფიციტის და კისტოზური ფიბროზის მქონე პირები მიდრეკილნი არიან ინფექციის მიმართ.ინფექცია ასევე შეიძლება მოხდეს ორალური და ანალური სექსით [2].ისეთი პრეპარატები, როგორიცაა მეტრონიდაზოლი, ტინიდაზოლი და ნიტაზოქსანიდი, თორმეტგოჯა ნაწლავის ინფექციების მკურნალობის უპირატესი ვარიანტებია [3].თუმცა, ეს ქიმიოთერაპიული პრეპარატები იწვევენ არასასურველ გვერდით მოვლენებს, როგორიცაა გულისრევა, კანცეროგენეზი და გენოტოქსიურობა [4].ამიტომ საჭიროა უფრო ეფექტური სტრატეგიების შემუშავება G. duodenalis ინფექციის თავიდან ასაცილებლად.
Inflammasomes არის ციტოზოლური ცილის კომპლექსების კლასი, რომლებიც წარმოადგენენ თანდაყოლილი იმუნური პასუხის ნაწილს, ეხმარება დაცვას პათოგენების შეჭრისგან და შუამავლობით ანთებით პასუხებს [5].ამ ანთებას შორის, ნუკლეოტიდ-დამკავშირებელი ოლიგომერიზაციის (NOD) რეცეპტორის 3 (NLRP3) ნუკლეოტიდ-დამკავშირებელი ოლიგომერიზაციის (NLRP3) ნუკლეოტიდ-დაკავშირების მსგავსი ანთება ფართოდ იქნა შესწავლილი, რადგან ის შეიძლება გამოვლინდეს სხვადასხვა პათოგენით/დაზიანებით ასოცირებული მოლეკულური შაბლონებით. DAMP), ამოიცნობს, ააქტიურებს თანდაყოლილ იმუნურ სისტემას.და არეგულირებს ნაწლავის ჰომეოსტაზს მრავალი ანთებითი დაავადების დროს [6,7,8].იგი შედგება ნიმუშის ამომცნობი რეცეპტორის (PRR) NLRP3, ადაპტერული აპოპტოზური ლაქოვანი ცილისგან (ASC) და ეფექტორის პროკასპაზა-1 ან პროკასპაზა-11.NLRP3 ანთებითი ნაწილი მოქმედებს როგორც მასპინძელი პათოგენის შეჭრის წინააღმდეგ, როგორც ეს დაფიქსირდა Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] და Leishmania კვლევებში.[11], მაგრამ ასევე ცნობილია, რომ NLRP3 ანთებითი პროცესის გააქტიურება ზღუდავს დამცავ იმუნურ პასუხებს და აძლიერებს დაავადების პროგრესირებას, მაგალითად, ჭიებში [12].ჩვენს წინა აღმოჩენებზე დაყრდნობით, ჩვენ შევატყობინეთ, რომ უჯრედგარე G. duodenalis იწვევს NLRP3 ანთების უჯრედშიდა აქტივაციას და ახდენს მასპინძლის ანთებითი რეაქციების მოდულირებას უჯრედგარე ვეზიკულების (EVs) სეკრეციით [13].თუმცა, NLRP3 ანთებითი ნაწილის როლი G. duodenalis ინფექციაში in vivo რჩება განსაზღვრული.
ჯიარდინები თავდაპირველად აღწერილი იყო, როგორც G. duodenalis ციტოჩონჩხის სტრუქტურული კომპონენტები და მნიშვნელოვან როლს ასრულებენ ტროფოზოიტების მოძრაობასა და ეპითელური უჯრედების მიმაგრებაში წვრილ ნაწლავში.გარემოსთან უკეთ ადაპტაციისთვის და მათი პათოგენურობის გასაზრდელად, G. duodenalis ტროფოზოიტებმა შეიმუშავეს უნიკალური ციტოჩონჩხის სტრუქტურა, რომელიც შედგება 8 ფლაგელა, 1 შუა სხეული და 1 ვენტრალური დისკი [14].Giardia-ს თორმეტგოჯა ნაწლავის ტროფოზოიტები იყენებენ ციტოჩონჩხს ზედა წვრილი ნაწლავის, განსაკუთრებით თორმეტგოჯა ნაწლავის შესაღწევად და ენტეროციტებზე დასამაგრებლად.ისინი მუდმივად მიგრირებენ და ემაგრებიან ეპითელურ უჯრედებს უჯრედული მეტაბოლიზმის გამოყენებით.აქედან გამომდინარე, არსებობს მჭიდრო კავშირი მათ ციტოჩონჩხსა და ვირულენტობას შორის.Giardia თორმეტგოჯა ნაწლავისთვის სპეციფიკური ჯიარდინები ციტოჩონჩხის სტრუქტურის კომპონენტებია [15] და იყოფა ოთხ კლასად: α-, β-, γ- და δ-გიარდინები.არსებობს α-გიარდინის ოჯახის 21 წევრი, რომელთაგან ყველა კალციუმზე დამოკიდებული ფოსფოლიპიდების შეკავშირების უნარია [16].ისინი ასევე აკავშირებენ ციტოჩონჩხს უჯრედის მემბრანასთან.G. duodenalis-ით გამოწვეული დიარეის მქონე პირებში, α-გიარდინები ძალიან გამოხატული და იმუნორეაქტიულია ინფექციის დროს [17].ჰეტეროლოგიური ვაქცინები, რომლებიც დაფუძნებულია Giardia alfa-1-ზე, იცავს თაგვებში გიარდიოზისგან და წარმოადგენს ვაქცინის განვითარების პოტენციურ კანდიდატ ანტიგენებს [18].ალფა-8 გიარდინი, რომელიც ლოკალიზებულია პლაზმურ მემბრანასა და ფლაგელაში, მაგრამ არა ვენტრალურ დისკში, აძლიერებს ტროფოზოიტების მოძრაობას და ზრდის ტემპს G. duodenalis-ში [19].Alpha-14 giardin მიმაგრებულია მიკროტუბულურ სტრუქტურებზე flagella-ზე და გავლენას ახდენს G. duodenalis-ის სიცოცხლისუნარიანობაზე [20].ალფა-11 ჯიარდინი უხვად არის წარმოდგენილი მთელი სასიცოცხლო ციკლის განმავლობაში და ალფა-11 გიარდინის გადაჭარბებული გამოხატვა აზიანებს თავად G. duodenalis-ს [21].თუმცა, გაურკვეველია არის თუ არა ალფა-2 გიარდინი და ალფა-7.3 ჯიარდინი დამცავი G. duodenalis ინფექციისა და მათი ძირითადი მექანიზმებისგან.
ამ კვლევაში, რეკომბინანტული ევკარიოტული ექსპრესიის პლაზმიდები pcDNA3.1(+)-ალფა-2 ჯიარდინი და pcDNA3.1(+)-ალფა-7.3 ჯიარდინი გადაყვანილი იქნა თაგვის პირველად პერიტონეალურ მაკროფაგებში მასპინძლის NLRP3-ის გასააქტიურებლად.შემდეგ ანთებითი სამიზნეების სკრინინგი ჩაუტარდა.ჩვენ ასევე შევაფასეთ NLRP3 ანთებითი პროცესის როლი G. duodenalis-ის პათოგენურობაში, გამოვიკვლიეთ, იწვევს თუ არა ალფა-2 და ალფა-7,3 ჯიარდინები NLRP3 ანთებითი პროცესების გააქტიურებას in vivo და დავადგინეთ, რომ გიარდინების ეს ორი როლი პათოგენურობაში. G. duodenalis.ჩვენი საერთო მიზანი იყო პერსპექტიული მიზნების შემუშავება G. duodenalis ინფექციის პროფილაქტიკისთვის.
ველური ტიპის (WT) C57BL/6 მდედრი თაგვები 5-8 კვირის ასაკში შეძენილი იქნა Liaoning Changsheng ექსპერიმენტული ცხოველთა ცენტრიდან (Liaoning, ჩინეთი).თაგვებს ჰქონდათ თავისუფალი წვდომა წყალზე, მიიღეს სტერილიზებული საკვები და ინახებოდა 12/12 საათის სინათლის/სიბნელის ციკლში.ინფიცირებამდე თაგვები იღებდნენ ანტიბიოტიკებს ad libitum სასმელ წყალში, რომელსაც ემატებოდა ამპიცილინი (1 მგ/მლ), ვანკომიცინი (1 მგ/მლ) და ნეომიცინი (1.4 მგ/მლ) (ყველა შეძენილი შანხაი, ჩინეთი, ხელოვნური ორგანიზმები) [22 ].].თაგვები, რომლებმაც დაკარგეს ჭამისა და სასმელის უნარი > 24 საათის განმავლობაში და დაკარგეს ≥ 20% სხეულის წონა, ჰუმანურად ევთანაზიეს საშვილოსნოს ყელის დისლოკაცია.
WB G. duodenalis ტროფოზოიტები (American Type Culture Collection, Manassas, USA) დაემატა 12.5% ​​ნაყოფის მსხვილფეხა რქოსანი შრატი (FBS; Every Green, Zhejiang, ჩინეთი) და 0.1% მსხვილფეხა რქოსანი ნაღველი (Sigma-Aldrich, St. Missouri, აშშ. ).აშშ) მიკროაერობულ პირობებში.შერწყმული ტროფოზოიტები აგროვებდნენ ყინულზე და გადიან 1:4 თანაფარდობით შემდგომი გამრავლებისთვის.
Giardia-ს თორმეტგოჯა ნაწლავის ცისტები ინდუცირებული იყო, როგორც ადრე იყო აღწერილი [23], ტროფოზოიტები აღებული იქნა ლოგარითმულ ფაზაში და შემდეგ განზავებული იყო ინკაფსულაციის გამომწვევი საშუალით, pH 7.1 (მოდიფიცირებული TYI-S-33) საბოლოო კონცენტრაციამდე 1 × 106 ტროფოზოიტი/მლ.ნაღვლის კონცენტრაცია 0,05% საშუალო).ტროფოზოიტები კულტივირებული იყო ანაერობულ პირობებში 37°C-ზე ლოგარითმული ზრდის ფაზამდე.გარემოს შეცვლა კისტას გამომწვევი გარემოთი (pH 7.8; მოდიფიცირებული TYI-S-33 გარემო 1% ნაღვლის კონცენტრაციით) და კულტივირება G. duodenalis 37°C-ზე 48-96 საათის განმავლობაში, რომლის დროსაც ცისტების წარმოქმნა დაფიქსირდა მიკროსკოპით.მას შემდეგ, რაც ტროფოზოიტების უმეტესობა გამოიწვევდა ცისტების წარმოქმნას, კულტურული ნარევი აღებული იქნა და ხელახლა შეჩერდა სტერილურ დეიონიზებულ წყალში დარჩენილი ტროფოზოიტების დასალიზატორად.ცისტები დაითვალეს და ინახებოდა 4°C-ზე შემდგომი ანალიზებისთვის თაგვებში კუჭის მილის მეშვეობით.
Giardia უჯრედგარე ვეზიკულები (GEVs) გამდიდრდა, როგორც ადრე იყო აღწერილი [13].ლოგარითმული ზრდის ფაზაში ტროფოზოიტები ხელახლა სუსპენდირებულ იქნა მოდიფიცირებულ TYI-S-33 გარემოში, მომზადებული ეგზოზომით დაცლილი FBS-ით (ბიოლოგიური ინდუსტრიები, Beit-Haemek, ისრაელი) საბოლოო კონცენტრაციამდე 1 × 106 პარაზიტი/მლ და ინკუბირებული იყო 12 საათის განმავლობაში.იზოლირებული იქნა კულტურის სუპერნატანტიდან ცენტრიფუგირებით 2000 გ-ზე 10 წუთის განმავლობაში, 10000 გ-ზე 45 წუთის განმავლობაში და 100000 გ-ზე 60 წუთის განმავლობაში.ნალექები იხსნება ფოსფატის ბუფერულ ფიზიოლოგიურ ხსნარში (PBS), რაოდენობრივად განსაზღვრულია BCA ცილის ანალიზის ნაკრების გამოყენებით (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, აშშ) და ინახება -80°C-ზე ან გამოიყენება პირდაპირ შემდგომი ანალიზებისთვის.
თაგვის პირველადი პერიტონეალური მაკროფაგები მომზადდა ისე, როგორც ზემოთ იყო აღწერილი [24].მოკლედ, თაგვებს (6-8 კვირის ასაკის) გაუკეთეს (ინტრაპერიტონეალურად [ip]) 2,5 მლ 2,98% Difco თხევადი თიოგლიკოლის საშუალო (BD, Franklin Lakes, NJ, აშშ) და იკვებება 3-4 პალატა.მაკროფაგების სუსპენზია შეგროვდა თაგვების მუცლის ღრუდან ევთანაზიის შემდეგ და ცენტრიფუგირებულ იქნა 3-ჯერ 1000 გ-ზე 10 წუთის განმავლობაში.დაკრეფილი უჯრედები გამოვლინდა ნაკადის ციტომეტრიით CD11b მარკერის გამოყენებით, სანამ უჯრედის სისუფთავე არ იყო >98%, შემდეგ დაემატა 6-ჭარის უჯრედის კულტურის ფირფიტებს (4.5 x 106 უჯრედი/ჭა) და ინკუბირებული იყო 10% FBS (ბიოინდუსტრიით) 37°C-ზე.და 5% CO2.
რნმ ამოღებულ იქნა 1 × 107 ტროფოზოიტიდან 1 მლ ტრიზოლის რეაგენტში (Vazyme, Nanjing, ჩინეთი), გენომიური დნმ ამოღებულ იქნა მთლიანი G. duodenalis რნმ-დან MonScript dsDNase-ს გამოყენებით (Monad, Wuhan, ჩინეთი) და სინთეზირებული იყო დამატებითი დნმ (cDNA). გამოყენებით MonScript RTIIII Super Mix (Monad) მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით.
CDS თანმიმდევრობის ინფორმაცია სამიზნე G. duodenalis გენისთვის მიღებული იყო NCBI GenBank-დან.გამოიყენეთ Primer 5.0 კონკრეტული უწყვეტი კლონირების პრაიმერების შესაქმნელად თითოეული სამიზნე გენისთვის.წინა პრაიმერი (5'-3') შედგება სამი ნაწილისგან: გადახურული თანმიმდევრობა ხაზოვანი ვექტორით pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) და საწყისი კოდონები ATG და GNN (თუ პირველი ბაზა არ არის G).ეს კეთდება გამოხატვის ეფექტურობის გასაუმჯობესებლად.გარდა ამისა, მინიმუმ 16 bp კომბინირებული ფუძე (GC შემცველობა 40–60%/Tm დაახლოებით 55 °C).საპირისპირო პრაიმერი (5'-3') შედგება ორი ნაწილისაგან, გადახურული თანმიმდევრობით EcoRV-ხაზოვანი ვექტორით pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) და კომბინირებული ფუძე მინიმუმ 16 bp.(ბოლო ორი გაჩერების გამოკლებით).ბაზები) კოდონი, როგორიცაა AA ან GA, რათა რეკომბინანტულ პლაზმიდებს საშუალება მისცეს გამოხატონ თავიანთი მარკირებული ცილები).პრაიმერის თანმიმდევრობები ჩამოთვლილია ცხრილში 1 და სინთეზირებულია Kangmet Biotechnology Co., Ltd.-ის მიერ (ჩანჩუნი, ჩინეთი).
სამიზნეები გაძლიერდა Pfu დნმ პოლიმერაზას (ტიანგენი, პეკინი, ჩინეთი) ან Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., პეკინი, ჩინეთი) გამოყენებით მომზადებული G. duodenalis cDNA შაბლონის სახით.ევკარიოტული ექსპრესიის ვექტორის პლაზმიდი pcDNA3.1(+) ხაზოვანი იყო შემაკავებელი ფერმენტით EcoRV და დეფოსფორილირებული იყო Fast AP (Thermo Fisher Scientific) გამოყენებით.ხაზოვანი pcDNA3.1(+) ფრაგმენტები და გაძლიერებული სამიზნე გენის ფრაგმენტები გაიწმინდა დნმ გელის გამწმენდი ნაკრების (Tiangen) გამოყენებით და რაოდენობრივად განსაზღვრული Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific) გამოყენებით.pcDNA3.1(+) ფრაგმენტი და თითოეული სამიზნე გენის ფრაგმენტი ხელახლა კომბინირებული იყო MonClone ერთჯერადი ასამბლეის კლონირების ნარევის გამოყენებით (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, ჩინეთი) და დადასტურდა დნმ-ის თანმიმდევრობით Comate Bioscience Company Limited-ის გამოყენებით (ჩანჩუნი, ჩინეთი)..
ენდოტოქსინისგან თავისუფალი პლაზმიდები pcDNA3.1(+)-ალფა-2 და pcDNA3.1(+)-ალფა-7.3 გენერირებული იყო SanPrep ენდოტოქსინისგან თავისუფალი პლაზმიდის მინი ნაკრების (Sangon Biotech) გამოყენებით.კონცენტრაცია შენარჩუნებული იყო 500 ნგ/მკლ-ზე ზემოთ, რათა უზრუნველყოფილიყო, რომ EDTA გამორეცხვის ბუფერში არ უშლიდა ხელს ტრანსფექციის ანალიზს.თაგვის პირველადი პერიტონეალური მაკროფაგები კულტივირებულ იქნა 6 ჭაბურღილის თეფშებში სრული RPMI 1640 გარემოთი (Biological Industries) 12 საათის განმავლობაში, შემდეგ უჯრედები გარეცხეს 3-ჯერ თბილ PBS-ში პენიცილინისა და სტრეპტომიცინის მოსაშორებლად, და შემდეგ გარემოში, რომელსაც დაემატა სრული გარემო.ენდოტოქსინისგან თავისუფალი პლაზმიდები pcDNA3.1(+)-ალფა-2 და pcDNA3.1(+)-ალფა-7.3 (2.5 მკგ) განზავებული იყო 125 მკლ Opti-MEM შემცირებულ შრატში (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..შემდეგ 5 მკლ Lipofectamine 2000 ტრანსფექციის რეაგენტი (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) განზავებულია 125 μl დაბალი შრატის Opti-MEM გარემოში.მოამზადეთ ლიპოსომა-დნმ კომპლექსები განზავებული ენდოტოქსინებისგან თავისუფალი პლაზმიდის Lipofectamine 2000-თან შერევით და ნარევი ოთახის ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში.კომპლექსები ცალ-ცალკე გადაიტანეთ უჯრედებში თითოეულ ჭაბურღილში და ნელა აურიეთ.4 საათის შემდეგ, უჯრედული კულტურის გარემო შეიცვალა 2 მლ სრული RPMI 1640 გარემოთი და კულტურა გაგრძელდა 24 საათის განმავლობაში.უჯრედების კულტურის ახალი გარემო დაემატა უჯრედებს და ინკუბირებული იყო სხვადასხვა დროის განმავლობაში, ანალიზის დიზაინის მიხედვით.
პროტეინის ნიმუშები სუპერნატანტებიდან და უჯრედის ლიზატებიდან მომზადდა ისე, როგორც ზემოთ იყო აღწერილი [25].მემბრანული გადაცემის პარამეტრები პრო-IL-1β, პრო-კასპაზა-1, კასპაზა-1 p20, NLRP3, β-აქტინისა და ჰის-ტეგისთვის იყო 200 mA/90 წთ.ინტერლეუკინისთვის 1β (IL-1β; R&D სისტემები, მინეაპოლისი, მინესოტა, აშშ), კასპაზა-1 (p20) (Adipogen, შვეიცარია) და NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, შვეიცარია) და 1:5000 მიზნად ისახავს მის ტეგს ( Amylet Scientific, ვუჰანი, ჩინეთი) და β-აქტინი (Proteintech, ვუჰანი, ჩინეთი).
დისკუცინიმიდის სუბერატთან (DSS) ჯვარედინი კავშირი განხორციელდა, როგორც ადრე იყო აღწერილი [26].უჯრედები გარეცხილი იქნა 3-ჯერ ცივი PBS-ით და მთლიანად გარეცხილი იქნა 27 დიამეტრის ნემსით 50 μl ASC რეაქციის ბუფერში (pH 8.0), რომელიც შეიცავდა 25 მმ Na2PO4, 187.5 მმ NaCl, 25 მმ HEPES და 125 მმ NaHCO3.ნარევი ცენტრიფუგირებული იყო 5000 გ-ზე 3 წუთის განმავლობაში და მარცვლები იკერებოდა 10 μl DSS (25 მმ DMSO-ში) და 40 μl ASC რეაქციის ბუფერით 30 წუთის განმავლობაში 37°C-ზე.ცენტრიფუგაციის შემდეგ 5000 გ-ზე 10 წუთის განმავლობაში, მარცვლები იხსნება 40 μl ASC რეაქციის ბუფერისა და 10 μl 6x ცილოვანი დატვირთვის ბუფერის ხსნარში (TransGen, პეკინი, ჩინეთი), შემდეგ კი ხსნარი ჩაქრა ოთახის ტემპერატურაზე 15 სთ. წთ., შემდეგ ადუღეთ 10 წუთი.პროტეინის ნიმუშები შემდეგ დაექვემდებარა Western blotting-ს პირველადი ანტი-ASC ანტისხეულების გამოყენებით (Wanleibio, Shenyang, China) განზავების თანაფარდობით 1:500.
ადრე აღწერილი პროცედურის შემდეგ [13], შეგროვდა უჯრედული კულტურის ზენატანები და განისაზღვრა ანთების პრო-ანთებითი ციტოკინის IL-1β სეკრეცია თაგვის IL-1 Beta ELISA ნაკრების გამოყენებით (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).გადაიყვანეთ OD450nm მნიშვნელობები ცილის კონცენტრაციად IL-1β სტანდარტული მრუდის გამოყენებით.
საფარებზე დაფარული უჯრედები ნაზად გაირეცხა 3-ჯერ თბილ PBS-ში, ფიქსირდება ქსოვილის უჯრედის ფიქსატორში (Biosharp, პეკინი, ჩინეთი) 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე (RT), 0.1% Triton X-Permeabilize-ში 100 (განზავებული PBS-ში; Biosharp). ) 20 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე და ბლოკირება 5% მსხვილფეხა რქოსანი შრატის ალბუმინით (PBS-ში) 2 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.შემდეგ უჯრედები ინკუბირებული იყო ღამით 4°C-ზე პირველადი ანტისხეულებით ASC-ის (1:100 განზავება) ან NLRP3 (1:100 განზავება), შესაბამისად, და Cy3 ეტიკეტირებული თხის საწინააღმდეგო კურდღლის IgG(H+L) (1:400; EarthOx). , San Francisco, CA, USA) ან FITC-კონიუგირებული თხის საწინააღმდეგო თაგვის IgG (1:400; Earthox) ღამით 37°C სიბნელეში 1 საათის განმავლობაში.ბირთვები შეღებილი იქნა Hoechst 33258-ით (10 მკგ/მლ; UE, სუჟოუ, ჩინეთი) 5 წუთის განმავლობაში და დაკვირვებული იქნა ფლუორესცენტური მიკროსკოპის ქვეშ (Olympus Corporation, ტოკიო, იაპონია).
თაგვები დაყვეს ოთხ ჯგუფად (n = 7 თითოეულ ჯგუფში): (i) PBS-ით დამუშავებული უარყოფითი საკონტროლო ჯგუფი (მხოლოდ PBS; 100 მკლ/თაგვის PBS, რასაც მოჰყვება ყოველდღიური ინტრაპერიტონეალური ინექცია 100 μl/თაგვის PBS 3 საათის შემდეგ)., უწყვეტად 7 დღის განმავლობაში);(ii) უარყოფითი საკონტროლო ჯგუფი, რომელსაც მკურნალობდა MCC950 ინჰიბიტორით [27] (100 მკლ/თაგვში PBS გაჟონვის საშუალებით, 3 საათის შემდეგ, 10 მგ/კგ სხეულის მასაზე [BW] MCC950 [PBS-ში] ინტრაპერიტონეალურად შეჰყავდათ ყოველდღიურად, ხანგრძლივობა 7 დღე);(iii) G. თორმეტგოჯა ნაწლავის კისტის ინფექციის ჯგუფი (1,5 x 106 კისტა/თაგვში გაჟონვით, 3 საათის შემდეგ, 100 მკლ/თაგვის PBS ინტრაპერიტონეალურად შეყვანილი ყოველდღიურად 7 დღის განმავლობაში);(iv) G. თორმეტგოჯა ნაწლავის კისტის კომბინირებული ინფექციის ჯგუფის MCC950 ინჰიბიტორის სამკურნალო ჯგუფი (1.5×106 კისტა/თაგვში გაჟონვის გზით, 10 მგ/კგ სხეულის მასაზე MCC950 ინტრაპერიტონეალურად ყოველდღიურად 7 დღის განმავლობაში 3 სთ-ზე).თითოეული თაგვის სხეულის წონა ყოველდღიურად კონტროლდებოდა და ყველა თაგვს ევთანაზია მე-7 დღეს ჩაუტარდა.დაკრეფილი თორმეტგოჯა ნაწლავი (3 სმ სიგრძის) დაჭრეს პატარა ნაჭრებად 1 მლ PBS-ში, ცისტები განადგურდა ღამით PBS-ში 4°C-ზე და G. duodenalis ტროფოზოიტები.ახალი თორმეტგოჯა ნაწლავი (1 სმ სიგრძის) იზოლირებული იყო ჰემატოქსილინისა და ეოზინის (H&E) შეღებვისთვის.
თაგვები დაიყო ორ ჯგუფად: (i) MOCK საკონტროლო ჯგუფი და (ii) MCC950 ინჰიბიტორი ჯგუფი.თითოეულ ჯგუფში იყო ხუთი მკურნალობა (n = 7/მკურნალობის ჯგუფი): (i) PBS მკურნალობის უარყოფითი საკონტროლო ჯგუფი (მხოლოდ PBS; 100 მკლ/თაგვის PBS, ინტრამუსკულური (IM) ინექცია (თიბიალური წინა ნაწილი) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) პლაზმიდური უარყოფითი საკონტროლო ჯგუფი (100 მკგ/თაგვის დნმ, ინტრამუსკულური ინექციის გზით) ჯგუფი, რომელსაც მკურნალობდა პლაზმიდ pcDNA3.1(+)-ალფა-2 (100 მკგ/თაგვის დნმ, ინტრამუსკულური ინექციით) და (v) ჯგუფი, რომელიც მკურნალობდა პლაზმიდ pcDNA3.1(+)-ალფა-7.3 (100 მკგ/თაგვი დნმ, 12 საათის გავლის შემდეგ, თაგვებმა MCC950 ინჰიბიტორთა ჯგუფში მიიღეს MCC950-ის ყოველდღიური ინტრაპერიტონეალური ინექცია (10 მგ/კგ სხეულის წონა) 7 დღის განმავლობაში, ხოლო MOCK ჯგუფში თაგვებმა მიიღეს თანაბარი მოცულობის PBS მკურნალობა. სისხლის ნიმუშები იყო შეგროვებული თაგვებიდან და დატოვეს ღამით 4 °C-ზე შრატის ნიმუშები იზოლირებული იყო ფერმენტთან დაკავშირებული იმუნოსორბენტული ანალიზის (ELISA) გამოყენებით და გაზომვებით IL-1β დონეზე.
ოცდათხუთმეტი თაგვი დაყო ხუთ ჯგუფად (n=7/ჯგუფი).ჯგუფი 1 იყო უარყოფითი საკონტროლო ჯგუფი, რომელსაც მკურნალობდა PBS: თაგვებმა მიიღეს 100 μl PBS ინტრამუსკულარულად და 3 დღის შემდეგ გაჟონვით.ჯგუფი 2 არის დადებითი საკონტროლო ჯგუფი, რომელიც ინფიცირებულია G. duodenalis ცისტებით: თაგვებს გაუკეთეს 100 μl PBS და 3 დღის შემდეგ 1.5 x 106 ცისტა/თაგვს გაუკეთეს ინტრაგასტრიკული ინექცია.მესამე ჯგუფი - პლაზმიდური იმუნიზაცია pcDNA3.1(+) საკონტროლო ჯგუფთან ერთად თორმეტგოჯა ნაწლავის კისტა ინფექციისთვის: თაგვებმა მიიღეს 100 მკგ პლაზმიდური დნმ pcDNA3.1(+)(im) პერორალურად, 1.5×106 კისტა/თაგვი 3 რამდენიმესთვის. დღეები.4 და 5 ჯგუფები იყო რეკომბინანტული pcDNA3.1(+)-ალფა-2 გიარდინის პლაზმიდი ან pcDNA3.1(+)-ალფა-7.3 ჯიარდინის პლაზმიდი G. duodenalis კისტის ინფექციასთან ერთად.ექსპერიმენტული ჯგუფი: თაგვებმა მიიღეს 100 მკგ pcDNA3.1(+)-გიარდინის პლაზმიდური დნმ (im), შემდეგ 3 დღის შემდეგ, 1.5 × 106 კისტა/თაგვს გაუკეთეს გაჟონვის საშუალებით.თითოეული თაგვის სხეულის წონა კონტროლდებოდა მილის მეშვეობით G. duodenalis კისტის შეყვანის შემდეგ.ახალი თორმეტგოჯა ნაწლავი შეგროვდა პარაზიტული დატვირთვის გაზომვისა და HE შეღებვის ანალიზისთვის.
ჰისტოპათოლოგიური ცვლილებები გაანალიზებულია ადრე გამოქვეყნებული პროცედურის მიხედვით [30].ახალი თორმეტგოჯა ნაწლავი დაფიქსირდა ქსოვილის უჯრედების ფიქსატორით, ჩაშენებული პარაფინში, მოჭრილი იყო 4 მკმ მონაკვეთებად, შეიღება H&E და გაანალიზდა მსუბუქი მიკროსკოპის ქვეშ.წარმომადგენლობითი პათოლოგიური ცვლილებები შვიდი დამოუკიდებელი თაგვის ქსოვილის შვიდ მონაკვეთში შეფასდა პათოლოგიის მიერ, რომელიც არ იცოდა მკურნალობის შესახებ და დაფიქსირდა 200x გადიდებით.ვილის სიგრძე და კრიპტების სიღრმე გაზომეს ადრე აღწერილი მეთოდების შესაბამისად.
შედეგები in vitro და in vivo მიღებული იქნა სამჯერ.გრაფიკები შეიქმნა GraphPad Prism 7.00-ის გამოყენებით (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).ორ ჯგუფს შორის განსხვავებები გაანალიზდა t-ტესტით, ხოლო ≥3 ჯგუფს შორის განსხვავებები გაანალიზებული იყო ცალმხრივი ვარიაციის ანალიზით (ANOVA) SPSS პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით (ვერსია 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, აშშ).მონაცემები გაანალიზებული იყო ვარიაციის ჰომოგენურობისთვის ლევენის ტესტის გამოყენებით, რასაც მოჰყვა ბონფერონის პოსტ-ჰოკ ტესტი (B).მნიშვნელოვნება გამოიხატება როგორც P<0.05, P<0.01 და P<0.001 (არამნიშვნელოვანი [ns]) (P>0.05).
GEV პროტეომიკის ჩვენმა წინა ანალიზმა გენების და გენომის კიოტოს ენციკლოპედიაში (KEGG) აჩვენა, რომ მრავალი სამიზნე შეიძლება იყოს ჩართული ანთებითი სასიგნალო გზების გააქტიურებაში [13].ჩვენ შევარჩიეთ ორი პერსპექტიული სამიზნე, ალფა-2 და ალფა-7.3 გიარდინები, გავაძლიერეთ ეს მოლეკულები და გამოვიყენეთ pcDNA3.1(+) ევკარიოტული ექსპრესიის ვექტორის ასაგებად.თანმიმდევრობის დადგენის შემდეგ, რეკომბინანტული pcDNA3.1(+)-ალფა-2 და ალფა-7.3 ჯიარდინის ექსპრესიის პლაზმიდები გადაიყვანეს პირველად თაგვის პერიტონეალურ მაკროფაგებში და იდენტიფიცირებული იყო ანთების კასპაზა-1 p20 ხელმოწერის პროტეინი (გააქტიურებული კასპაზა-1-ის ფრაგმენტი). როგორც ძირითადი მოლეკულების გარკვევა, რომლებსაც შეუძლიათ ანთების გამოწვევა.შედეგებმა აჩვენა, რომ ალფა-2 და ალფა-7.3 გიარდინებს შეუძლიათ გამოიწვიონ p20 კასპაზა-1 გამოხატულება GEV-ის მსგავსი.კასპაზა-1-ის აქტივაციაზე არანაირი ეფექტი არ იქნა ნაპოვნი არანამკურნალევ ნეგატიურ კონტროლში (მხოლოდ PBS) და პლაზმიდურ საკონტროლო pcDNA3.1(+) (სურათი 1).
p20 კასპაზა-1-ის აქტივაციის გაზომვა pcDNA3.1(+)-ალფა-2 და ალფა-7.3 გიარდინებით.რეკომბინანტული ევკარიოტული ექსპრესიის პლაზმიდები pcDNA3.1(+)-ალფა-2 და ალფა-7.3 ჯიარდინები (თითოეული ზოლის ზემოთ) გადაიყვანეს პირველად თაგვის პერიტონეალურ მაკროფაგებში და კულტურის სუპერნატანტები აღებული იქნა 24 საათის შემდეგ.Western blotting გამოიყენებოდა ხელმოწერის კასპაზა-1 p20 ანთებითი ცილის ექსპრესიის დონის გასაზომად.PBS-მხოლოდ მკურნალობის ჯგუფი (ხაზი C) და pcDNA3.1(+) მონოთერაპიის ჯგუფი (pcDNA3.1 ხაზი) ​​გამოყენებული იყო როგორც უარყოფითი კონტროლი, ხოლო GEV მკურნალობის ჯგუფი გამოყენებული იყო როგორც დადებითი კონტროლი.რეკომბინანტული ცილის გამოხატვა დადასტურდა თითოეულ ცილაში ჰისტიდინის ტეგის გამოვლენით და მოსალოდნელი ცილის ზოლები იყო ალფა-2 გიარდინი (38.2 კდა) და ალფა-7.3 გიარდინი (37.2 კდა).GEV, Giardia თორმეტგოჯა ნაწლავის უჯრედგარე ვეზიკულები, pcDNA3.1(+), EcoRV-ხაზოვანი ვექტორი, SUP, სუპერნატანტი
იმის დასადგენად, იწვევენ თუ არა ალფა-2 გიარდინი და ალფა-7.3 ჯიარდინი p20 კასპაზა-1 ექსპრესიას და თამაშობენ როლს მასპინძლის NLRP3 ანთებითი პასუხის გააქტიურებაში, pcDNA3.1(+)-ალფა-2 გიარდინი და pcDNA3.1(+)-ალფა. -7.3 გიარდინი ტრანსფექტირდა თაგვის პირველად პერიტონეალურ მაკროფაგებში რეკომბინანტული პლაზმიდური დნმ-ით და განისაზღვრა ძირითადი ანთებითი ცილების NLRP3 გამოხატვის დონე, ლოკალიზაცია და ოლიგომერიზაცია.ამ ექსპერიმენტში, GEV გამოიყენებოდა, როგორც დადებითი საკონტროლო ჯგუფი, ხოლო მკურნალობის გარეშე ჯგუფი (მხოლოდ PBS) ან pcDNA3.1(+) ტრანსფექციის სამკურნალო ჯგუფი იყო უარყოფითი ჯგუფი.შედეგებმა აჩვენა, რომ, ისევე როგორც GEV ჯგუფში, გიარდინის pcDNA3.1(+)-ალფა-2-ისა და გიარდინის pcDNA3.1(+)-ალფა-7.3-ის რეკომბინანტულმა პლაზმიდურმა დნმ-მა გამოიწვია NLRP3, პრო-IL-1β და ამაღლებული რეგულაცია. პროკასპაზა-1 და კასპაზა-1 აქტივაცია (ნახ. 2ა).გარდა ამისა, ორივე გიარდინმა გამოიწვია მნიშვნელოვანი IL-1β სეკრეცია (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; ალფა-2 ჯიარდინი: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;ალფა-7.3 გიარდინი: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (სურათი 2b).ASC პროტეინების უმეტესობა მონომერული იყო უმკურნალო ჯგუფში ან სამკურნალო ჯგუფში, რომელიც გადაიზარდა pcDNA3.1(+) პლაზმიდით, განსხვავებით pcDNA3.1(+)-ალფა-2 ან pcDNA3.1(+)-ალფა-. 7.3 ჯიარდინი.ASC ოლიგომერიზაცია მოხდა GEV დადებითი საკონტროლო ჯგუფის ან ჯგუფის რეკომბინანტულ პლაზმიდურ დნმ-ში, რომელიც აჩვენებს ოლიგომერულ ფორმას (სურათი 2c).ეს წინასწარი მონაცემები ვარაუდობს, რომ ალფა-2 გიარდინს და ალფა-7,3 ჯიარდინს შეუძლიათ გამოიწვიონ NLRP3 ანთების აქტივაცია.ASC და NLRP3-ის ლოკალიზაციის შემდგომმა იმუნოფლუორესცენტულმა კვლევებმა აჩვენა, რომ უარყოფითი საკონტროლო ჯგუფში, ASC ცილა მიმოფანტული იყო მთელ ციტოპლაზმაში და გამოჩნდა წერტილის სიგნალის სახით pcDNA3.1(+)-ალფა-2 ჯიარდინით ან pcDNA3-ით სტიმულირებისას.1(+)-ალფა-7,3 გიარდინის ჯგუფი ან GEV დადებითი საკონტროლო ჯგუფი (სურათი 2d).ნეგატიური კონტროლისა და პლაზმიდით დამუშავებული pcDNA 3.1 ჯგუფებში, NLRP3 პროტეინის სიგნალი არ იყო გამოვლენილი, ხოლო ფლუორესცენტური სიგნალის წერტილი pcDNA3.1(+)-ალფა-2 გიარდინზე ან pcDNA3.1(+)-ალფა-7.3 საპასუხოდ. გამოვლინდა..ჯიარდინი გვხვდება ციტოპლაზმაში ან HEV-ის სტიმულირებისას (ნახ. 2e).ეს მონაცემები დამატებით აჩვენებს, რომ G. duodenalis giardin alpha-2 და giardin alpha-7.3 ააქტიურებენ NLRP3 ანთებას თაგვის პირველად პერიტონეალურ მაკროფაგებში.
pcDNA3.1(+)-ალფა-2 გიარდინი და pcDNA3.1(+)-ალფა-7.3 ჯიარდინი ააქტიურებენ NLRP3 ანთებით თაგვის პერიტონეალურ მაკროფაგებში.რეკომბინანტული ევკარიოტული ექსპრესიის პლაზმიდები pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin და pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin გადაიყვანეთ პირველად თაგვის პერიტონეალურ მაკროფაგებსა და უჯრედებში, ან მიიღეთ სუპერნატანტი 24 საათის განმავლობაში ექსპრესიის ანალიზისთვის, ოლიგომერიზაცია. , სეკრეცია.და ძირითადი ანთებითი ცილების ლოკალიზაცია.PBS-მხოლოდ (C) ჯგუფი და pcDNA3.1(+) ერთჯერადი მკურნალობის ჯგუფი გამოყენებული იყო, როგორც უარყოფითი კონტროლი, და GEV მკურნალობის ჯგუფი გამოყენებული იყო, როგორც დადებითი ჯგუფი.a ძირითადი ანთებითი ცილები NLRP3, მათ შორის NLRP3, პრო-IL-1β, პრო-კასპაზა-1 და p20 კასპაზა-1, გამოვლინდა Western blotting-ით.b IL-1β-ის სეკრეციის დონე სუპერნატანტებში განისაზღვრა ფერმენტთან დაკავშირებული იმუნოსორბენტული ანალიზის (ELISA) გამოყენებით.განსხვავებები საკონტროლო და ექსპერიმენტულ ჯგუფებს შორის გაანალიზებული იყო ცალმხრივი დისპერსიის ანალიზით (ANOVA) SPSS პროგრამული უზრუნველყოფის 22.0 ვერსიის გამოყენებით.ვარსკვლავი მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებს ჯგუფებს შორის **P<0.01 და ***P<0.001.c ASC ოლიგომერიზაციის დონეები მარცვლებში განისაზღვრა DSS ჯვარედინი კავშირის ანალიზით, ხოლო ASC დონეები უჯრედის ლიზატებში გამოყენებული იყო როგორც დატვირთვის კონტროლი.d ISC ლოკალიზაციის ვიზუალიზაცია იმუნოფლუორესცენციის გამოყენებით.e იმუნოფლუორესცენცია იქნა გამოყენებული NLRP3-ის ლოკალიზაციის ვიზუალიზაციისთვის.ASC, აპოპტოზური ლაქების მსგავსი ცილა;IL, ინტერლეუკინი;NLRP3, ნუკლეოტიდის დამაკავშირებელი ოლიგომერიზაციის მსგავსი რეცეპტორი 3;ns, არ არის მნიშვნელოვანი (P > 0.05)
როგორც G. duodenalis, ასევე GEV-ები, რომლებიც მას გამოყოფს, ააქტიურებენ NLRP3 ანთებით პროცესს და არეგულირებენ მასპინძლის ანთებით პასუხებს in vitro.ამრიგად, NLRP3 ანთებითი ნაწილის როლი G. duodenalis-ის პათოგენურობაში რჩება გაურკვეველი.ამ საკითხის გამოსაკვლევად, ჩვენ შევადგინეთ ექსპერიმენტი G. duodenalis კისტით დაინფიცირებულ თაგვებსა და G. duodenalis კისტათი + MCC950 ინჰიბიტორით ინფიცირებულ თაგვებს შორის და შევადარეთ NLRP3 ანთებითი ექსპრესია G. duodenalis კისტათი ინფიცირებისას.ექსპერიმენტის დეტალური სქემა ნაჩვენებია ნახ. 3ა.თაგვების სხეულის წონის ცვლილებები სხვადასხვა სამკურნალო ჯგუფში მონიტორინგდა 7 დღის განმავლობაში ცისტებით ინფექციის შემდეგ და შედეგები ნაჩვენებია ნახ. 3b.ჯგუფთან შედარებით, რომელიც მკურნალობდა სუფთა PBS-ით, შედეგებმა აჩვენა, რომ (i) G. duodenalis კისტათი ინფიცირებული თაგვების სხეულის წონა შემცირდა ინფექციის შემდეგ მე-3 დღიდან მე-7 დღეს;(ii) MCC950 ინჰიბიტორით მკურნალობას არ ჰქონდა მნიშვნელოვანი გავლენა თაგვების სხეულის წონაზე..ერთჯერადი ინფექციის ჯგუფთან შედარებით, თორმეტგოჯა ნაწლავის ინფექციის ჯგუფის BW, რომელსაც მკურნალობდა MCC950, შემცირდა სხვადასხვა ხარისხით (დღე 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; დღე 2: ANOVA, F(3, 24 ) = 0.4602, P<0.0001; დღე 3: ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010: ANOVA, F(3, 24) = 1.683, P = 0.0052 F (3, 24)=0.6497, P=0.0645; დღე 6: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175 დღე: ANOVA, F(3, 24) = 2.893, P = 0.0202).ეს მონაცემები აჩვენებს, რომ NLRP3 ანთება იცავს თაგვებს წონის მნიშვნელოვანი დაკლებისგან თორმეტგოჯა ნაწლავის ინფექციის ადრეულ სტადიაზე (2-4 დღე).შემდეგ ჩვენ მიზნად დავისახეთ G. duodenalis ტროფოზოიტების გამოვლენა თორმეტგოჯა ნაწლავის ამორეცხვაში და შედეგები ნაჩვენებია სურათზე 3c.G. თორმეტგოჯა ნაწლავის ცისტური ინფექციის ჯგუფთან შედარებით, თორმეტგოჯა ნაწლავში ტროფოზოიტების რაოდენობა მნიშვნელოვნად გაიზარდა NLRP3-ის ანთების ბლოკირების შემდეგ (t(12) = 2.902, P = 0.0133).HE-ით შეღებილმა თორმეტგოჯა ნაწლავის ქსოვილებმა, მხოლოდ PBS და MCC950-ით დამუშავებულ უარყოფით კონტროლთან შედარებით, აჩვენა: (i) G. დუოდენალის ცისტის ინფექციამ გამოიწვია თორმეტგოჯა ნაწლავის ჯირკვლის დაზიანება (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P=0.0488. ) და კრიპტის ატროფია (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) თორმეტგოჯა ნაწლავი თაგვებიდან, რომლებიც ინფიცირებულია G. duodenalis ცისტებით და მკურნალობენ MCC950 ინჰიბიტორებით.თორმეტგოჯა ნაწლავი დაზიანებული და მკვდარი იყო (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) ატროფიით და კრიპტის განშტოებით (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (ნახ. 3d- ვ) .ეს შედეგები ვარაუდობს, რომ NLRP3 ანთებითი ნაწილი თამაშობს როლს G. duodenalis-ის პათოგენურობის შემცირებაში.
NLRP3 ანთებითი ნაწილის როლი Giardia თორმეტგოჯა ნაწლავის ინფექციაში.თაგვებს ჩაუტარდათ გაჟონვა (iv) თორმეტგოჯა ნაწლავის ცისტებით და შემდეგ მკურნალობდნენ MCC950-ით ან მის გარეშე (IP).ერთჯერადი მკურნალობის ჯგუფები PBS ან MCC950 იყო გამოყენებული როგორც კონტროლი.ექსპერიმენტული ჯგუფი და მკურნალობის რეჟიმი.b თაგვების სხეულის წონა თითოეულ სამკურნალო ჯგუფში იყო მონიტორინგი 7 დღის განმავლობაში.განსხვავება G. duodenalis ინფექციის ჯგუფსა და G. duodenalis + MCC950 ინფექციის მკურნალობის ჯგუფს შორის გაანალიზებული იყო t-ტესტით SPSS პროგრამული უზრუნველყოფის 22.0 ვერსიის გამოყენებით.ვარსკვლავი მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებს *P<0.05, **P<0.01 ან ***P<0.001.c პარაზიტული დატვირთვა განისაზღვრა თორმეტგოჯა ნაწლავის ამორეცხვის სითხეში ტროფოზოიტების რაოდენობის დათვლით.განსხვავება G. duodenalis ინფექციის ჯგუფსა და G. duodenalis + MCC950 ინფექციის მკურნალობის ჯგუფს შორის გაანალიზებული იყო t-ტესტით SPSS პროგრამული უზრუნველყოფის 22.0 ვერსიის გამოყენებით.ვარსკვლავი მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებს *P <0.05-ზე.d თორმეტგოჯა ნაწლავის ჰისტოპათოლოგიის ჰემატოქსილინისა და ეოზინის (H&E) შეღებვის შედეგები.წითელი ისრები მიუთითებს ღრძილების დაზიანებაზე, მწვანე ისრები მიუთითებს კრიპტების დაზიანებაზე.მასშტაბის ზოლი: 100 μm.e, f თორმეტგოჯა ნაწლავის ვილის სიმაღლისა და თაგვის კრიპტის სიმაღლის სტატისტიკური ანალიზი.ვარსკვლავი მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებზე *P<0.05 და **P<0.01.შედეგები აღებულია 7 დამოუკიდებელი ბიოლოგიური ექსპერიმენტიდან.BW, სხეულის წონა;ig, ინტრაგასტრიკული მიწოდების გზა;ip, ინტრაპერიტონეალური მიწოდების გზა;ns, არ არის მნიშვნელოვანი (P > 0.05);PBS, ფოსფატის ბუფერული ფიზიოლოგიური ხსნარი;WT, ველური ტიპი
IL-1β სეკრეცია არის ანთების გააქტიურების ნიშანი.იმის დასადგენად, ააქტიურებენ თუ არა G. duodenalis alpha-2 giardine და alpha-7.3 giardine NLRP3 მასპინძლის ანთებას in vivo, ჩვენ გამოვიყენეთ არანამკურნალევი WT თაგვები (sham ჯგუფი) და NLRP3 ანთებითი ბლოკირებული თაგვები (MCC950 ინჰიბირებული მკურნალობის ჯგუფი).ექსპერიმენტის დეტალური სქემა ნაჩვენებია ნახ. 4ა.ექსპერიმენტული ჯგუფები შედგებოდა თაგვებისგან, რომლებსაც მკურნალობდნენ PBS, G. duodenalis კისტის მკურნალობა გაჟონვით, pcDNA3.1-ის ინტრამუსკულური ინექცია და pcDNA3.1(+)-ალფა-2 გიარდინის ან pcDNA3.1-ალფა-7.3 ჯიარდინის ინტრამუსკულური ინექცია.რეკომბინანტული პლაზმიდის ინტრამუსკულური მიღებიდან მე-7 დღეს შეგროვდა შრატი და განისაზღვრა IL-1β დონე თითოეულ ჯგუფში.როგორც 4b სურათზეა ნაჩვენები, MOCK ჯგუფში: (i) PBS ჯგუფთან შედარებით, pcDNA3.1 მკურნალობას არ ჰქონდა მნიშვნელოვანი ეფექტი IL-1β სეკრეციაზე (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), თუმცა, IL-β სეკრეცია მნიშვნელოვნად გაიზარდა G. duodenalis კისტის ჯგუფში (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-ალფა-2 გიარდინი და pcDNA3.1- ალფა-7.3 გიარდინის ინტრამუსკულური ინექცია მნიშვნელოვნად ზრდიდა შრატში IL-1β დონეს (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-ალფა-7,3 გიარდინმა გამოიწვია IL-1β სეკრეციის მაღალი დონე pcDNA3.1-ალფა-2 ჯიარდინის ინტრამუსკულური ინექციის ჯგუფში (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .MCC950 მკურნალობის ჯგუფში და MOCK ჯგუფში თითოეულ ჯგუფთან შედარებით: (i) IL-1β სეკრეციის დონე PBS საკონტროლო ჯგუფში და pcDNA3.1 საკონტროლო ჯგუფში შემცირდა გარკვეულწილად MCC950 ინჰიბიტორის ბლოკირების შემდეგ, მაგრამ განსხვავება არ იყო მნიშვნელოვანი (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) MCC950-ის დაბლოკვის შემდეგ., IL-1β სეკრეცია მნიშვნელოვნად შემცირდა G. duodenalis ცისტით ინფიცირებულ ჯგუფში, pcDNA3.1-ალფა-2 ჯიარდინის ჯგუფში და pcDNA3.1-alpha-7.3 ჯიარდინის ჯგუფში (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3,540, P = 0,0120 pcDNA3,1-ალფა-2 ჯიარდინი: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447 pcDNA3,1-ალფა-7,3 ჯიარდინი: ANOVA, F(; ) = 3,540, P = 0,0164).ეს შედეგები ვარაუდობს, რომ ალფა-2 გიარდინი და ალფა-7.3 გიარდინი შუამავლობენ NLRP3 ანთებითი პროცესების გააქტიურებას in vivo.
pcDNA3.1(+)-გიარდინები ააქტიურებენ NLRP3 მასპინძლის ანთებას in vivo.თაგვები იმუნიზირებული იყო (IM) რეკომბინანტული ევკარიოტული ექსპრესიის პლაზმიდით pcDNA3.1(+)-ალფა-2 ჯიარდინით ან pcDNA3.1(+)-ალფა-7.3 ჯიარდინით და შემდეგ მკურნალობდნენ MCC950-ით (ip; MCC950 ჯგუფი) ან არა (მატყუარა ჯგუფი). ).PBS ან pcDNA3.1(+) პლაზმიდური მკურნალობის ჯგუფი გამოიყენებოდა როგორც უარყოფითი კონტროლი, G. duodenalis კისტის სამკურნალო ჯგუფი გამოიყენებოდა როგორც დადებითი კონტროლი.ექსპერიმენტული ჯგუფი და მკურნალობის რეჟიმი.b შრატში IL-1β დონეები თაგვებში გაზომილი იყო მე-7 დღეს ELISA ანალიზით.MOCK ჯგუფში ჯგუფებს შორის განსხვავებები გაანალიზებული იყო ცალმხრივი ANOVA-ს გამოყენებით, და განსხვავებები MOCK ჯგუფსა და MCC950 ჯგუფს შორის გაანალიზებული იყო SPSS პროგრამული უზრუნველყოფის 22.0 ვერსიის t-ტესტის გამოყენებით.ვარსკვლავი მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებს სამკურნალო ჯგუფებს შორის MOCK ჯგუფში, *P<0.05 და ***P<0.001;დოლარის ნიშნები ($) მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებას თითოეულ ჯგუფს შორის MOCK ჯგუფსა და MCC950 ჯგუფს შორის P<0.05-ზე.შვიდი დამოუკიდებელი ბიოლოგიური ექსპერიმენტის შედეგები.i, ინტრამუსკულური ინექცია, ns, არ არის მნიშვნელოვანი (P > 0.05)
ალფა-2 და ალფა-7.3 ჯიარდინით განპირობებული NLRP3 მასპინძლის ანთებითი აქტივაციის ეფექტის გამოსაკვლევად G. duodenalis ინფექციაზე, ჩვენ გამოვიყენეთ WT C57BL/6 თაგვები და გაუკეთეს ალფა-2 გიარდინი და ალფა-7.3 გიარდინი.პლაზმიდი შეიყვანეს ინტრამუსკულარულად, 3 დღის შემდეგ G. duodenalis კისტის კუჭის მილის მეშვეობით, რის შემდეგაც თაგვებს აკვირდებოდნენ 7 დღის განმავლობაში.ექსპერიმენტის დეტალური სქემა ნაჩვენებია ნახ.5ა.თითოეული თაგვის სხეულის წონა იზომებოდა ყოველდღე, თორმეტგოჯა ნაწლავის ახალი ქსოვილის ნიმუშები გროვდებოდა მიღებიდან მე-7 დღეს კუჭის მილის მეშვეობით, გაზომილი იყო ტროფოზოიტების რაოდენობა და დაფიქსირდა ჰისტოპათოლოგიური ცვლილებები.როგორც 5b სურათზეა ნაჩვენები, კვების დროის მატებასთან ერთად, თითოეულ ჯგუფში თაგვების წონა თანდათან გაიზარდა.თაგვების MT დაიწყო შემცირება G. duodenalis კისტების ინტრაგასტრიკული შეყვანიდან მე-3 დღეს, შემდეგ კი თანდათან გაიზარდა.ალფა-2 გიარდინისა და ალფა7.3 გიარდინის ინტრამუსკულური ინექციით გამოწვეული NLRP3 ანთებითი აქტივაციის გააქტიურებამ მნიშვნელოვნად შეასუსტა წონის დაკლება თაგვებში (დღე 1: pcDNA3.1-ალფა-2 გიარდინი, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P. = 0.9754 დღე 1: pcDNA3.1-ალფა-7.3 ჯიარდინი, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 დღე 2: pcDNA3.1-ალფა-2 გიარდინი, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.9979 დღე 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 დღე 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083 დღე 4: pcDNA3.1-ANOVA , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, დღე 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P <0.0001, დღე 5: pcDNA3.1-alpha - 2 ჯიარდინი, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 დღე 5: pcDNA3.1-ალფა -7.3 ჯიარდინი, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 დღე 6: პცDNA3. ალფა-2 გიარდინი, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, დღე 6: pcDNA3.1-ალფა-7.3 გიარდინი, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;დღე 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 დღე 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001).პარაზიტული დატვირთვა შეფასდა თორმეტგოჯა ნაწლავში (ნახ. 5c).არანამკურნალევი დადებითი კონტროლისა და ცარიელი pcDNA3.1 ვექტორის ინექციის ჯგუფთან შედარებით, G. duodenalis ტროფოზოიტების რაოდენობა მნიშვნელოვნად შემცირდა ჯგუფებში, რომლებსაც შეჰყავდათ α-2 გიარდინი და α-7,3 გიარდინი (pcDNA3.1-ალფა -2 ჯიარდინი: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-ალფა-7.3 გიარდინი: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001).გარდა ამისა, ჯიარდინ ალფა-7.3 უფრო დამცავი იყო თაგვებში, ვიდრე ჯიარდინ ალფა-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081).HE შეღებვის შედეგები ნაჩვენებია ნახ.5d–f.თაგვებს, რომლებსაც გაუკეთეს ალფა-2 ჯიარდინი და ალფა-7.3 ჯიარდინი, ჰქონდათ ნაკლები თორმეტგოჯა ნაწლავის ქსოვილის დაზიანებები, რაც გამოიხატება ვილუსის დაზიანებით, ვიდრე თაგვებს, რომლებსაც გაუკეთეს G. duodenalis და თაგვებს, რომლებსაც გაუკეთეს G. duodenalis ცარიელ pcDNA3 ვექტორთან ერთად .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 ან P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0028 ან P = 0.0055) და შემცირებული კრიპტის ატროფია (pcDNA3.1-ალფა-2 გიარდინი: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 ან P = 0.0158; pcDNA3.1-ალფა-2 ANOVA. , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 ან P = 0,0191).ეს შედეგები ვარაუდობს, რომ ალფა-2 გიარდინი და ალფა-7,3 ჯიარდინი ამცირებენ G. duodenalis-ის ინფექციურობას NLRP3 ანთებითი პროცესების in vivo გააქტიურებით.
pcDNA3.1(+)-გიარდინების როლი G. duodenalis ინფექციაში.თაგვები იმუნიზირებული იყო (IM) რეკომბინანტული ევკარიოტული ექსპრესიის პლაზმიდებით pcDNA3.1(+)-ალფა-2 გიარდინით ან pcDNA3.1(+)-ალფა-7.3 ჯიარდინით და შემდეგ გამოწვეულ იქნა G. duodenalis ცისტებით (ig).PBS ჯგუფი და pcDNA3.1(+) + თორმეტგოჯა ნაწლავის კისტის სამკურნალო ჯგუფი გამოიყენებოდა, როგორც უარყოფითი საკონტროლო ჯგუფები, ხოლო თორმეტგოჯა ნაწლავის კისტის სამკურნალო ჯგუფი გამოიყენებოდა როგორც დადებითი საკონტროლო ჯგუფი.ექსპერიმენტული ჯგუფი და მკურნალობის რეჟიმი.b თაგვების MT მკურნალობის სხვადასხვა ჯგუფში იყო მონიტორინგი გამოწვევის შემდეგ 7 დღის განმავლობაში.ვარსკვლავი მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებს ჯგუფებს შორის G. duodenalis ჯგუფში და pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ჯგუფში, *P <0.05, **P <0.01 და ***P <0.001;დოლარის ნიშანი ($) მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებას G. duodenalis-ის თითოეულ ჯგუფსა და pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine ჯგუფს შორის, $$P<0.01 და $$$P<0.001.c პარაზიტული დატვირთვა განისაზღვრა თორმეტგოჯა ნაწლავის 1 მლ თორმეტგოჯა ნაწლავის ამორეცხვაში ტროფოზოიტების რაოდენობის დათვლით (სიგრძით 3 სმ) და გამოიხატება როგორც პარაზიტების რაოდენობა თორმეტგოჯა ნაწლავის სმ-ზე.განსხვავებები G. duodenalis ინფექციის ჯგუფს, pcDNA3.1(+)-ალფა-2 გიარდინის ჯგუფსა და pcDNA3.1(+)-ალფა-7.3 ჯიარდინის ჯგუფს შორის გაანალიზებული იყო ცალმხრივი ANOVA-ით SPSS პროგრამული უზრუნველყოფის ვერსიის 22.0-ის გამოყენებით.ვარსკვლავი მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებზე **P<0.01 და ***P<0.001.დ ჰისტოპათოლოგიური ცვლილებები თორმეტგოჯა ნაწლავში.წითელი ისრები მიუთითებს ღრძილების დაზიანებაზე, მწვანე ისრები მიუთითებს კრიპტების დაზიანებაზე.მასშტაბის ზოლი: 100 μm.e, f თაგვის თორმეტგოჯა ნაწლავის ვილის სიმაღლის (ე) და კრიპტის სიმაღლის (f) სტატისტიკური ანალიზი.სურათზე 1d ჯგუფებს შორის განსხვავებები გაანალიზებული იყო ცალმხრივი ANOVA-ით SPSS პროგრამული უზრუნველყოფის ვერსიის 22.0-ის გამოყენებით.ვარსკვლავი მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებზე *P<0.05 და **P<0.01.შვიდი დამოუკიდებელი ბიოლოგიური ექსპერიმენტის შედეგები.ns, არ არის მნიშვნელოვანი (P > 0.05)
Giardia duodenum არის ადამიანებისა და სხვა ძუძუმწოვრების ცნობილი ნაწლავური პარაზიტი, რომელიც იწვევს ჯიარდიასს.2004 წელს იგი შედიოდა ჯანმო-ს უგულებელყოფილი დაავადებების ინიციატივაში მისი მაღალი გავრცელების გამო 6 წლის განმავლობაში, განსაკუთრებით დაბალი სოციალურ-ეკონომიკური მდგომარეობის მქონე თემებში [32].თანდაყოლილი იმუნური სისტემა მნიშვნელოვან როლს ასრულებს G. duodenalis ინფექციის იმუნურ პასუხში.ცნობილია, რომ თაგვის მაკროფაგები შთანთქავენ და კლავენ G. duodenalis-ს უჯრედგარე ხაფანგების გათავისუფლებით [33].ჩვენმა წინა კვლევებმა აჩვენა, რომ G. duodenalis, არაინვაზიური უჯრედგარე პარაზიტი, ააქტიურებს p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 და NLRP3 ანთებით სასიგნალო გზებს თაგვის მაკროფაგებში მასპინძლის ანთებითი რეაქციების დასარეგულირებლად, და გამოთავისუფლებულმა GEV შეიძლება გააძლიეროს ეს პროცესი.13], 24].თუმცა, ზუსტი PAMP-ები, რომლებიც ჩართულია NLRP3 ანთებით რეგულირებულ ანთებაში GEV-ში და NLRP3 ანთებითი პროცესების როლი გიარდიაზში, ჯერ კიდევ გასარკვევია.ამ ორი საკითხის გასანათებლად ჩვენ ჩავატარეთ ეს კვლევა.
NLRP3 inflammasome მდებარეობს იმუნური უჯრედების ციტოპლაზმაში და შეიძლება გააქტიურდეს სხვადასხვა ნაწილაკებით, როგორიცაა შარდმჟავას კრისტალები, ტოქსინები, ბაქტერიები, ვირუსები და პარაზიტები.ბაქტერიულ კვლევებში ტოქსინები გამოვლინდა, როგორც ძირითადი PAMP, რომლებიც ააქტიურებენ ანთებით სენსორებს, რაც იწვევს ანთებას და უჯრედების სიკვდილს [34].ზოგიერთი სტრუქტურულად მრავალფეროვანი ტოქსინი, როგორიცაა ჰემოლიზინი Staphylococcus aureus-დან [35] და Escherichia coli [36], ჰემოლიზინი BL (HBL) ენტეროტოქსინიდან (NHE) [37], იწვევს NLRP3 ანთების გააქტიურებას.ვირუსულმა კვლევებმა აჩვენა, რომ ვირულენტური ცილები, როგორიცაა SARS-COV-2 კონვერტის (E) ცილა [38] და ზიკა ვირუსის NS5 ცილა [39] მნიშვნელოვანი PAMP-ებია, რომლებიც აღიარებულია NLRP3 რეცეპტორის მიერ.პარაზიტების კვლევებში დაფიქსირდა მრავალი პარაზიტი, რომლებიც დაკავშირებულია მასპინძლის ანთების აქტივაციასთან, როგორიცაა Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] და Leishmania [42].მკვრივი გრანულების ცილები GRA35, GRA42 და GRA43, რომლებიც დაკავშირებულია Toxoplasma gondii-ის ვირულენტობასთან, საჭიროა ლუისის ვირთხების მაკროფაგებში პიროპტოზის ინდუქციისთვის [43].გარდა ამისა, ლეიშმანიის ზოგიერთი კვლევა ფოკუსირებულია ცალკეულ მოლეკულებზე, რომლებიც ჩართულნი არიან NLRP3-ის ანთებაში, როგორიცაა პარაზიტის მემბრანის ლიპოფოსფოგლიკანი [44] ან თუთიის მეტალოპროტეაზა [45].ანექსინის მსგავსი ალფა-გიარდინის გენების ოჯახს შორის, ალფა-1 გიარდინი ნაჩვენებია, როგორც პოტენციური ვაქცინის კანდიდატი, რომელიც უზრუნველყოფს დაცვას G. duodenalis-ისგან თაგვის მოდელში [18].ჩვენს კვლევაში, ჩვენ შევარჩიეთ G. duodenalis ვირულენტობის ფაქტორები ალფა-2 და ალფა-7,3 გიარდინები, რომლებიც უნიკალურია გიარდიისთვის, მაგრამ შედარებით ნაკლებად მოხსენებული.ეს ორი სამიზნე გენი კლონირებულ იქნა pcDNA3.1(+) ევკარიოტული ექსპრესიის სისტემის ვექტორში ანთების აქტივაციის ანალიზისთვის.
ჩვენს თაგვის მოდელში, გატეხილი კასპაზის ფრაგმენტები ემსახურება ანთებითი აქტივაციის მარკერებს.სტიმულირებისას, NLRP3 ურთიერთქმედებს ASC-თან, აგროვებს პროკასპაზებს და წარმოქმნის აქტიურ კასპაზებს, რომლებიც ანაწილებენ პრო-IL-1β და პრო-IL-18 სექსუალურ IL-1β და IL-18, შესაბამისად -18.ანთებითი კასპაზები (კასპაზები-1, -4, -5 და -11) არის ცისტეინის პროტეაზების კონსერვირებული ოჯახი, რომლებიც გადამწყვეტია თანდაყოლილი თავდაცვისთვის და მონაწილეობენ ანთებასა და უჯრედების დაპროგრამებულ სიკვდილში [46].კასპაზა-1 გააქტიურებულია კანონიკური ანთებითი კვანძებით [47], ხოლო კასპაზები-4, -5 და -11 იშლება ატიპიური ანთებითი პროცესების წარმოქმნის დროს [48].ამ კვლევაში ჩვენ გამოვიყენეთ თაგვის პერიტონეალური მაკროფაგები, როგორც მოდელი და გამოვიკვლიეთ p20 კასპაზა-1 დაშლილი კასპაზა-1, როგორც მასპინძელი NLRP3 ანთების აქტივაციის მარკერი G. duodenalis ინფექციის კვლევებში.შედეგებმა აჩვენა, რომ მრავალი ალფა-გიარდინი პასუხისმგებელია ანთების ტიპურ გააქტიურებაზე, რაც შეესაბამება ბაქტერიებსა და ვირუსებში ჩართული ძირითადი ვირულენტური მოლეკულების აღმოჩენას.თუმცა, ჩვენი კვლევა მხოლოდ წინასწარი სკრინინგია და არსებობს სხვა მოლეკულები, რომლებსაც შეუძლიათ არაკლასიკური ანთებითი პროცესების გააქტიურება, რადგან ჩვენმა წინა კვლევამ აღმოაჩინა როგორც კლასიკური, ასევე არაკლასიკური ანთებითი ჯირკვლები G. duodenalis ინფექციაში [13].შემდგომში იმის დასადგენად, არის თუ არა გენერირებული p20 კასპაზა-1 ასოცირებული NLRP3 ანთებასთან, ჩვენ გადავიყვანეთ ალფა-2 და ალფა-7.3 გიარდინები თაგვის პერიტონეალურ მაკროფაგებში, რათა განვსაზღვროთ ძირითადი მოლეკულის ცილის ექსპრესიის დონეები და ASC ოლიგომერიზაციის დონეები, რაც დაადასტურა, რომ ორივე α-გიარდინი აქტიურდება. ანთებითი NLRP3.ჩვენი შედეგები ოდნავ განსხვავდება Manko-Prykhoda et al.-ის შედეგებისგან, რომლებმაც განაცხადეს, რომ Caco-2 უჯრედების სტიმულაცია მხოლოდ G. muris ან E. coli EPEC შტამებით შეიძლება გაზარდოს NLRP3, ASC და კასპაზა-1-ის ფლუორესცენციის ინტენსივობა. თუმცა არა მნიშვნელოვნად, მაშინ როდესაც G. muris-ისა და E. coli-ს კოსტიმულაციამ გაზარდა სამი ცილის დონე [49].ეს შეუსაბამობა შეიძლება გამოწვეული იყოს Giardia-ს სახეობების, უჯრედული ხაზების და პირველადი უჯრედების შერჩევის განსხვავებებით.ჩვენ ასევე ჩავატარეთ in vivo ანალიზები MCC950-ის გამოყენებით 5 კვირის მდედრობითი სქესის WT C57BL/6 თაგვებში, რომლებიც უფრო მგრძნობიარენი არიან G. duodenalis-ის მიმართ.MCC950 არის ძლიერი და შერჩევითი მცირე მოლეკულის NLRP3 ინჰიბიტორი, რომელიც ბლოკავს კანონიკურ და არაკანონიკურ NLRP3 აქტივაციას ნანომოლარულ კონცენტრაციებში.MCC950 აფერხებს NLRP3 აქტივაციას, მაგრამ არ ახდენს გავლენას AIM2, NLRC4 და NLRP1 ანთებითი გზების ან TLR სასიგნალო გზების გააქტიურებაზე [27].MCC950 ბლოკავს NLRP3 აქტივაციას, მაგრამ არ აფერხებს NLRP3 ინიცირებას, K+ გადინებას, Ca2+ შემოდინებას ან NLRP3-სა და ASC-ს შორის ურთიერთქმედებას;სამაგიეროდ, ის აფერხებს NLRP3 ანთებითი აქტივაციას ASC ოლიგომერიზაციის ბლოკირებით [27].ამიტომ, ჩვენ გამოვიყენეთ MCC950 in vivo კვლევაში, რათა განვსაზღვროთ NLRP3 ანთებითი პროცესის როლი გიარდინის ინექციის შემდეგ.გააქტიურებული კასპაზა-1 p10 არღვევს ანთების პრო-ციტოკინებს პრო-IL-1β და პრო-IL-18 სექსუალურ IL-1β და IL-18 [50].ამ კვლევაში შრატში IL-1β დონეები ჯიარდინით ნამკურნალევ თაგვებში MCC950-ით ან მის გარეშე გამოიყენეს, როგორც ინდიკატორი იმისა, იყო თუ არა NLRP3 ანთებითი პროცესის გააქტიურება.როგორც მოსალოდნელი იყო, MCC950 მკურნალობა მნიშვნელოვნად ამცირებს შრატში IL-1β დონეს.ეს მონაცემები ნათლად აჩვენებს, რომ G. duodenalis giardin alfa-2 და giardin alfa-7.3 შეუძლიათ გაააქტიურონ NLRP3 თაგვის ანთება.
გასული ათწლეულის განმავლობაში დაგროვილმა მნიშვნელოვანმა მონაცემებმა აჩვენა, რომ IL-17A არის G. muris-ის წინააღმდეგ იმუნიტეტის მთავარი რეგულატორი, რომელიც იწვევს IL-17RA სიგნალიზაციას, აწარმოებს ანტიმიკრობულ პეპტიდებს და არეგულირებს კომპლემენტის აქტივაციას [51].თუმცა, Giardia ინფექცია უფრო ხშირად გვხვდება ახალგაზრდა მოზარდებში და ცნობილია, რომ Giardia ინფექცია ახალგაზრდა თაგვებში არ ააქტიურებს IL-17A პასუხს მისი დამცავი ეფექტის განსახორციელებლად [52], რაც მკვლევარებს უბიძგებს სხვა იმუნომოდულაციური ჯიარდიის ძებნაში.ჰელმინთური ინფექციის მექანიზმები.ბოლო კვლევის ავტორებმა განაცხადეს, რომ G. muris-ს შეუძლია გაააქტიუროს NLRP3 ანთება E. coli EPEC-ით, რაც ხელს უწყობს ანტიმიკრობული პეპტიდების გამომუშავებას და ამცირებს მის მიმაგრების შესაძლებლობებს და ტროფოზოიტების რაოდენობას ნაწლავის ტრაქტში, რითაც ამცირებს მსხვილი ნაწლავის სიმძიმეს. ბაცილებით გამოწვეული დაავადებები [49].NLRP3 inflammasome ჩართულია სხვადასხვა დაავადების განვითარებაში.კვლევებმა აჩვენა, რომ Pseudomonas aeruginosa იწვევს აუტოფაგიას მაკროფაგებში, რათა თავიდან აიცილოს უჯრედების სიკვდილი და ეს პროცესი დამოკიდებულია NLRP3 ანთებითი პროცესის გააქტიურებაზე [53].N. caninum-ისთვის, NLRP3 ანთებითი ჯიშის რეაქტიული ჟანგბადის სახეობებით გააქტიურებული აქტივაცია ზღუდავს მის რეპლიკაციას მასპინძელში, რაც მას პოტენციურ თერაპიულ სამიზნედ აქცევს [9].დადგინდა, რომ Paracoccidioides brasiliensis იწვევს NLRP3 ანთებითი პროცესების გააქტიურებას თაგვის ძვლის ტვინის დენდრიტულ უჯრედებში, რის შედეგადაც გამოიყოფა ანთებითი ციტოკინი IL-1β, რომელიც მნიშვნელოვან როლს ასრულებს მასპინძლის დაცვაში [10].ლეიშმანიის რამდენიმე სახეობა, მათ შორის L. amazonensis, L. major, L. braziliensis და L. infantum chagasi, ააქტიურებს NLRP3 და ASC-დამოკიდებულ კასპაზა-1 მაკროფაგებში, ასევე ლეიშმანიით ინფექციას.პარაზიტის რეპლიკაცია გაძლიერებულია თაგვებში, რომლებსაც აქვთ NLRP3/ASC/კასპაზა-1 გენი [11].ზამბონი და სხვ.ლეიშმანიით ინფექცია იწვევს მაკროფაგებში NLRP3 ანთებითი პროცესის გააქტიურებას, რაც ზღუდავს უჯრედშიდა პარაზიტის რეპლიკაციას.ამრიგად, ლეიშმანიამ შესაძლოა დათრგუნოს NLRP3 აქტივაცია, როგორც აცილების სტრატეგია.in vivo კვლევებში, NLRP3 ანთებითი პროცესი ხელს უწყობდა ლეიშმანიის ელიმინაციას, მაგრამ არ იმოქმედა ქსოვილებზე [54].პირიქით, ჰელმინთოზის კვლევებში, NLRP3 ანთებითი პროცესის გააქტიურებამ თრგუნა მასპინძლის დამცავი იმუნიტეტი კუჭ-ნაწლავის ჰელმინთოზის წინააღმდეგ [12].შიგელა არის ერთ-ერთი მთავარი ბაქტერია, რომელიც იწვევს დიარეას მთელ მსოფლიოში.ამ ბაქტერიებს შეუძლიათ გამოიწვიონ IL-1β წარმოება P2X7 რეცეპტორების შუამავლობით K+ გამონადენის, რეაქტიული ჟანგბადის სახეობების, ლიზოსომური მჟავიანობის და მიტოქონდრიული დაზიანების მეშვეობით.NLRP3 ანთება უარყოფითად არეგულირებს ფაგოციტოზს და მაკროფაგების ბაქტერიციდულ აქტივობას შიგელას წინააღმდეგ [55].პლაზმოდიუმის კვლევებმა აჩვენა, რომ AIM2, NLRP3 ან კასპაზა-1 დეფიციტური თაგვები, რომლებიც ინფიცირებულია პლაზმოდიუმით, აწარმოებენ 1 ტიპის ინტერფერონის მაღალ დონეს და უფრო მდგრადნი არიან პლაზმოდიუმის ინფექციის მიმართ [56].თუმცა, ალფა-2 გიარდინისა და ალფა-7.3 გიარდინის როლი თაგვებში NLRP3 ანთების პათოგენური აქტივაციის გამოწვევაში გაურკვეველია.
ამ კვლევაში, MCC950-ით NLRP3 ანთებითი პროცესის დათრგუნვამ შეამცირა BW და გაზარდა ტროფოზოიტების რაოდენობა ნაწლავის გამორეცხვის სითხეში თაგვებში, რაც იწვევს უფრო მძიმე პათოლოგიურ ცვლილებებს თორმეტგოჯა ნაწლავის ქსოვილში.Alpha-2 giardine და alpha-7.3 giardine ააქტიურებენ მასპინძელი თაგვის NLRP3 ანთებას, ზრდის თაგვის სხეულის წონას, ამცირებს ტროფოზოიტების რაოდენობას ნაწლავის ამორეცხვაში და ამსუბუქებს თორმეტგოჯა ნაწლავის პათოლოგიურ დაზიანებებს.ეს შედეგები ვარაუდობს, რომ G. duodenalis-ს შეუძლია გაააქტიუროს NLRP3 მასპინძლის ანთება alpha-2 giardine და alpha-7,3 giardine, რაც ამცირებს G. duodenalis-ის პათოგენურობას თაგვებში.
ერთობლივად, ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ ალფა-2 და ალფა-7.3 გიარდინები იწვევენ NLRP3 მასპინძლის ანთებითი პროცესების გააქტიურებას და ამცირებს G. duodenalis-ის ინფექციურობას თაგვებში.ამიტომ, ეს მოლეკულები პერსპექტიული სამიზნეებია გიარდიოზის პროფილაქტიკისთვის.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: მიმოხილვა.ცოტა ხნის წინ გაირკვა, რომ Pat Inflamm ალერგიულია წამლების მიმართ.2019; 13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: ფარმაკოთერაპიის მიმოხილვა.ფარმაცევტის ექსპერტის აზრი.2007 წელი;8: 1885–902 წწ.
თიან ჰუაფენგი, ჩენ ბინ, ვენ ჯიანფენგი.ჯიარდიაზი, წამლისმიერი წინააღმდეგობა და ახალი სამიზნეების აღმოჩენა.აინფიცირებს Disord ნარკოტიკების სამიზნეებს.2010; 10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T და ა.შ. NLRP3 ანთებითი და ანთებითი დაავადებები.Oxide Med Cell Longev.2020; 2020: 4063562.
Chen GY, Núñez G. ანთებითი პროცესის როლი ნაწლავის ანთებასა და კიბოს დროს.გასტროენტეროლოგია.2011 წელი;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. კანონიკური და ატიპიური NLRP3 ანთებითი აქტივაცია იმუნური ტოლერანტობისა და ნაწლავის ანთების გზაჯვარედინზე.წინასწარი იმუნური.2017; 8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, და სხვ.ROS შუამავლობით NLRP3 ანთებითი აქტივაცია ჩართულია N. caninum ინფექციის საპასუხოდ.პარაზიტის ვექტორი.2020; 13:449.